微生物侵入法：守护密封完整性的重要手段

作者：杭州惠世微生物中心

在药品、食品、医疗器械等行业，容器的密封完整性至关重要。它不仅关系到产品的质量、安全性和稳定性，还直接影响消费者的健康和企业的声誉。️微生物侵入法作为一种经典的检测方法，凭借其独特的优势和可靠的检测结果，成为评估容器密封完整性的重要手段之一。

️一、微生物侵入法的原理与操作

微生物侵入法的原理是模拟微生物侵入容器的过程。具体而言，将经过灭菌处理的容器灌装培养基后密封，再将其密封面浸入高浓度的菌液中，使菌液充分接触封口内表面。经过一段时间的浸泡后，取出容器并培养，观察是否有微生物侵入瓶内，从而判断容器的密封性能。

操作步骤如下：

微生物侵入试验过程

️1试验前准备

1.1样品灭菌

在超净工作台内，将阳性样品空包材（通过激光打孔的方式进行制样，孔径分别为3μm、5μm、10μm、15μm，各10个）及阴性样品（合格空包材，15个），用含0.5%过氧乙酸的70%异丙醇浸泡4小时，使用无菌水冲洗后置于超净工作台的紫外灯下照射30分钟。

1.2培养基配制

TSB：按照30g胰酪大豆胨液体培养基加入1000ml纯化水的比例配制TSB培养基，在121℃高压蒸汽灭菌15分钟，pH值测定合格后备用。

TSA：按照40g胰酪大豆胨琼脂培养基加入1000ml纯化水的比例配制TSA培养基，在121℃高压蒸汽灭菌15分钟，pH值测定合格后备用。

1.3培养基灌装

在超净工作台内，将TSB培养基按照5ml/个灌装入阳性/阴性样品空包材中，密封。

1.4预培养

将灌装完成后的样品放入无菌袋中，置于32℃培养箱中培养14天，若所有样品的培养基均澄清，则可进行后续微生物侵入试验。若有样品的培养基出现浑浊，则不得进行下一步试验，需重新制备该类型样品。

️2测试用菌株制备

2.1菌悬液制备

从菌株复苏的斜面上，用接种环挑取一环缺陷短波单胞菌，接种入2000ml TSB中，于32℃下培养48h。培养结束后的菌悬液可用作微生物侵入试验（用于侵入法的菌悬液的浓度需达到106cfu/ml或以上）。

2.2侵入前菌悬液计数

移取上述1ml待侵入的菌悬液，加入到9ml稀释液中进行梯度稀释，选择2-3个适宜的稀释级，分别移取1ml稀释后的菌悬液，加入空平皿中，每个稀释级平行2块平皿，倾注15-20ml TSA培养基混合均匀，置于32℃培养箱，培养1-3天后计数。

菌悬液浓度达到106cfu/ml或以上，为合格。

2.3侵入后菌悬液计数（该步骤在完成侵入试验后立即进行）

移取1ml已完成侵入的菌悬液，加入到9ml稀释液中进行梯度稀释，选择2-3个适宜的稀释级，分别移取1ml稀释后的菌悬液，加入空平皿中，每个稀释级平行2块平皿，倾注15-20ml TSA培养基混合均匀，置于32℃培养箱，培养1-3天后计数。

菌悬液浓度达到106cfu/ml或以上，为合格。

️3营养性试验I

取阴性样品5个，接入少于100cfu的缺陷短波单胞菌，在恒温培养箱中32℃条件下培养7天（若所有试样均出现明显浑浊，可提前结束培养）。

若5个阴性样品的培养基出现明显浑浊，确认生长良好，则判为营养性试验合格。

若有阴性样品的培养基未变浑浊，则判为营养性试验失败。

️4微生物侵入试验

4.1将装有合格浓度的菌悬液的容器放入密封性测试仪/智能型密封仪的配套容器内，将试样（阳性样品、阴性样品）放入，使试样的封口外表面及阳性样品的打孔部位完全浸没在菌悬液中，同时试样包装内的培养基应充分接触封口内表面和打孔部位。

如下图所示：

4.2采用压力-40kPa→常压，每个条件下入侵时间设置为0.5h的条件进行微生物侵入试验。侵入试验条件具体见表格P4-1。

4.3侵入完成后，立即从菌悬浮液中取出试样，在生物安全柜内擦干试样外残留的菌悬液，然后用0.5%过氧乙酸的70%异丙醇消毒其外表面。

4.4侵入后培养

将各组试样置于32℃恒温培养箱内培养7天。

培养结束后，观察检查每组试样中微生物的生长情况。有生长的记为“+”，无生长的记为“-”。

4.5菌种确认

对所有肉眼观察浑浊长菌的样品，需确认样品封口是否完好，生长菌是否为对应的侵入菌种。

4.6侵入培养后营养性试验II

对肉眼观察未长菌的阴性样品和阳性孔径中未侵入的样品随机选取5个（若不满5个，则全部选取），进行营养性试验，具体操作及结果判定参见“3营养性试验I”。

5结果记录

记录仅有目标菌生长的供试样品数量。

6试验有效性

需同时符合以下条件，本试验方为有效：

Ø侵入前后的菌悬液浓度均在106cfu/ml或以上；

Ø营养性试验I结果合格；

Ø阴性样品未发现侵入；

Ø各孔径阳性样品侵入的微生物经确认为侵入菌；

Ø侵入培养后营养性试验II结果合格；

7试验灵敏度

以在此样本量下的100%侵入的阳性样品的最小孔径作为本产品微生物侵入试验的灵敏度。

️二、微生物侵入法的优势

微生物侵入法具有以下显著优势：

• 高灵敏度：能够检测到极微小的泄漏点，确保包装的密封性能。即使是微小的孔隙或裂缝，也可能被微生物侵入，从而被检测出来。

• 模拟真实环境：通过模拟微生物侵入的实际情况，更贴近实际使用场景，结果更具可靠性。这种方法能够真实地反映容器在实际使用过程中可能面临的微生物污染风险。

• 适用范围广：适用于多种包装形式，如西林瓶、安瓿瓶、输液袋、预充针、滴眼剂等。无论是玻璃容器还是塑料包装，微生物侵入法都能有效检测其密封性。

• 无损检测：不会对样品或包装材料造成损伤，适用于批量检测。检测后的样品在未发现微生物侵入的情况下，仍可继续用于其他测试或研究。

️三、微生物侵入法的局限性

尽管微生物侵入法具有诸多优点，但也存在一些局限性：

• 主观性强：结果判断依赖于微生物生长的观察，可能存在一定的主观性。不同的观察者可能会对培养基中微生物生长的迹象有不同的判断。

• 破坏性：一旦发现微生物侵入，样品通常会被污染，无法进行后续的重复测试。

• 耗时长：整个测试过程包括预培养、浸泡和后续培养，通常需要数天至数周时间。这对于需要快速检测结果的企业来说可能是一个挑战。

• 对环境要求高：需要严格的无菌操作环境，以避免外界微生物的干扰。如果操作环境不达标，可能会导致假阳性或假阴性的结果。

️四、微生物侵入法的应用领域

微生物侵入法在多个领域都有着广泛的应用：

• 药品包装：用于检测注射剂、滴眼剂等药品包装的密封性，确保药品在有效期内不受微生物污染。药品的密封性直接关系到药品的质量和安全性，微生物侵入法能够有效保障药品包装的完整性。

• 食品包装：评估食品包装在运输和储存过程中的密封性能，防止微生物侵入，延长食品保质期。食品包装的密封性不仅影响食品的口感和品质，还关系到消费者的健康。

• 医疗设备包装：检测医疗设备包装的密封完整性，防止微生物污染，确保医疗设备的安全和有效性。医疗设备的密封性对于防止交叉感染至关重要。

️五、微生物侵入法的未来发展方向

随着科技的不断进步，微生物侵入法也在不断发展和改进。一方面，研究人员正在努力提高检测的自动化程度，减少人为因素的干扰，提高检测结果的准确性和可靠性。例如，通过引入图像识别技术和自动化培养设备，可以更快速、准确地判断微生物的生长情况。另一方面，微生物侵入法与其他检测方法（如真空衰减法、激光顶空分析法等）的联合应用也越来越受到关注。通过多种方法的互补，可以更全面地评估容器的密封完整性，提高检测的效率和准确性。

️六、结论

微生物侵入法作为一种经典的容器密封完整性检测方法，凭借其独特的优势和可靠的检测结果，已经成为药品、食品、医疗设备等行业不可或缺的检测手段。尽管存在一些局限性，但通过不断的技术改进和与其他方法的联合应用，微生物侵入法有望在未来的密封完整性检测中发挥更大的作用。我们期待微生物侵入法在未来能够更加精准、高效地保障产品的密封性和安全性，为人类的健康和福祉做出更大的贡献。

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