默迪夫解析 | 增强多肽体内稳定性的有效方法
相比化药，多肽药物具有低毒性、低免疫原性、高组织渗透性等优点，但其缺点也很明显：一方面，其较小的尺寸意味着它们能够被肾脏从血液中过滤；另一方面，其较差的穿膜性会导致很容易被体内的各种酶降解。这些因素使得大部分多肽类药物在体内的半衰期很短，因此，对其结构进行改造或修饰，以延长其在体内的半衰期成了多肽药物研发的重点之一。
️多肽结构的改造多肽之所以在生物体内不稳定，是因为其特殊的分子结构。多肽主链上容易发生脱酰胺反应，特别是位于分子表面的酰胺基团容易被蛋白酶识别和水解。侧链上氨基酸残基容易发生构象变化，例如α-螺旋的解离和盐桥的断裂等。为了解决多肽在结构上的不稳定性，许多研究者致力于对多肽的结构进行改造，这些改造主要思路是降低多肽结构参与降解反应的活泼性。
1.1 形成环肽
与直链肽相比，环肽具有更好的结构稳定性。通过二硫键将多肽首尾相连形成环肽或者利用半胱氨酸形成分子内小环，使肽链失去游离的氨基和羧基，避免被特异性识别端基氨基和羧基的蛋白酶降解。而且，成环的多肽分子内会形成二硫键或者盐桥，这些相互作用会进一步提高多肽的稳定性。
1.2 使用D-型氨基酸
由于体内蛋白酶所能识别的氨基酸为天然的L-型氨基酸，所以研究者们尝试用D-型氨基酸来替代多肽链中的L-型氨基酸。有些研究者仅将多肽链的C端和N端的氨基酸用D-型氨基酸替代，而有的则将多肽链中所有氨基酸改变为D-型氨基酸。研究人员选取MUC2 粘蛋白中的一段抗原决定簇（15TPTPTGTQTPT25），分别将C端和N端3个氨基酸替换为D-型氨基酸或者将两端3个氨基酸同时替换为D-型氨基酸，研究它们在人血清中的稳定性。结果发现N端替换成D-型氨基酸（Pep2和Pep3）后对多肽的稳定性具有很大提升。如Pep2，在10％和50％血清中的降解率分别为16％和45％。在N 和C末端同时具有3个D-型氨基酸的肽链即使在50％人血清中96h后也是稳定的。其中Pep4和Pep5这两条肽链既具有很高的蛋白酶稳定性，又具有很好的特异性识别抗体的能力。
（图1 15TPTPTGTQTPT25的两端替换情况）
1.3 改变多肽中单个或多个氨基酸
多肽链主链与主链之间、侧链与侧链之间主要靠静电作用维系结构稳定，可以通过替换掉其中几个氨基酸来增强多肽链之间的静电作用。
️多肽两端进行修饰将多肽两端进行修饰是保护多肽免于蛋白酶降解的有效策略；将多肽两端进行脂肪链修饰，由于疏水作用的增加，可以增强多肽的结构稳定性。用PEG来修饰多肽，则可以让多肽达到隐形的目的。将多肽与无机化合物结合并自组装成纳米粒子则可以隐藏多肽的C-端和N-端，从而具有抗氨肽酶和羧肽酶降解的作用。
2.1 对多肽进行疏水修饰
抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）作为新型抗肿瘤药物具有重要价值，该多肽具有很高的细胞特异性和对肿瘤细胞抗多药耐药（ multiple drugresistance，MDR）的特性。将脂肪酸与AMP结合可以增加多肽的疏水性，使多肽的螺旋结构更稳定， 并且有助于提高多肽的抗菌活性。
2.2 对多肽进行亲水修饰
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是辅助癌症治疗的潜在靶标，因为它们在促进癌细胞增殖、血管生成和转移中具有重要的作用。M2巨噬细胞属于TAM 的一种。巨噬细胞靶向肽（M2pep）可以与M2细胞特异性结合，但由于M2pep的水溶性差，不易在体内发挥效力。为了提高M2pep 在体内的稳定性，研究者将M2pep连接到一种聚合物上。该聚合物主要由N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）和N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺（APMA）组成。HPMA 具有较好的亲水性和生物相容性，而APMA 的作用主要是提供可以与多肽相结合的氨基。
研究者将3种M2pep肽类似物与聚合物连接，分别形成M2pep-SH、(Ac)M2pep(RY)-SH 和DFBP-cyclized M2pep(RY)-Alkyne。研究后发现，与聚合物相结合后，多肽在血清中即使是24h后也保持稳定，而3种游离肽类似物在相同时间内活性减半。特别是将环化的M2pep(RY)与聚合物相结合后既保留了靶向性，又增加了多肽在体内的稳定性。
️生物大分子对多肽的修饰与其它蛋白质相比，血浆中的白蛋白和IgG的半衰期相对较长，因此将多肽与这些蛋白结合后能够延长多肽的半衰期。研究者设计将两个白蛋白连接形成一个空腔，再将GLP-1激动剂exendin-4肽与空腔部分连接形成白蛋白-多肽-白蛋白的夹心结构。exendin-4肽含有一个精氨酸和两个赖氨酸残基，它们是胰蛋白酶的切割位点，这样的结构可以保护多肽免于酶促降解。
️对多肽进行物理包裹除了对多肽本身进行修饰，还可以使用高分子物质包裹多肽，在多肽与蛋白酶之间形成屏障从而保护其免于蛋白酶切割。研究者设计了一种纳米级药物传递系统，用于口服递送GLP-1。其策略是将肽附着在固体纳米颗粒二氧化硅上，然后再用pH 敏感聚合物丙烯酸树脂包裹（SPN-GLP-1）。当pH为7.4时GLP-1释放了80%，而当pH为1.0时GLP-1也只有30%左右的释放，因此pH 敏感丙烯酸树脂很好的保护了GLP-1在胃等酸性条件下的稳定性。在肠酶稳定性方面，研究者将游离GLP-1 和SPN-GLP-1与肠液混合。由于存在高浓度的消化酶和刷状缘肽酶，GLP-1 迅速降解，半衰期为(2±0.02) min，即使在第4 min，SPN-GLP-1还有70%完整的GLP-1。
有其它研究策略是使用具有自组装活性的疏水蛋白将GLP-1分子包裹在自组装腔内，从而防止GLP-1被蛋白酶降解。
（图2 疏水蛋白包裹GLP-1的过程）
联合使用多种方法对多肽结构进行改造，不仅可以改善多肽的稳定性，而且可以增强多肽的细胞结合能力、抗肿瘤能力以及克服血脑屏障的能力。
M2肽（YEQDPWGVKWWYGGGSKK(K-Biotin)）可以在CT-26结肠癌模型中成功的靶向M2巨噬细胞。但是，M2肽的血清稳定性差，这限制了M2肽在体内的作用。研究者发现，M2肽血清稳定性差主要是因为其肽链N末端的溶解性切割和W10/W11和S16/K17位点的内切裂解。
研究对M2肽进行N-末端乙酰化、D-氨基酸取代和环化等改变后，合成了一种M2肽的衍生物Cyclic-M2pep(RY)Biotin肽（ CGYEQDPWGVRYWYGCDKDKDK(K-Biotin)）。此肽通过将M2肽进行环化来消除N-末端的切割，将末端3个赖氨酸替换为D-型氨基酸，改善了S16/K17位点处的血清稳定性。改造后的M2肽在血清中即使是48h后仍可被检测到，显示出非常好的血清蛋白酶稳定性，并且与受体结合的能力也得到了很好的改善。
