缩宫素的制备

摘要：以Rink.Amide树脂为载体,Fmoc保护的氨基酸为原料,采用Fmoc/tBu固相多肽合成法,按缩宫素的肽序列合成还原型缩宫素粗肽,环化后经制备型RP-HPLC纯化得纯度为99%的缩宫素,总收率34.0%。

️关键词： 缩宫素 固相多肽合成 环化

缩宫素(oxytocin),又称催产素,分子式为C43H66N12O12S2,相对分子量为1 007.2,是一种由9个氨基酸残基组成的多肽类药物 [1] ,其氨基酸序列为:Cys1-Tyr2-Ile3-Gln4-Asn5-Cys6-Pro7-Leu8-Gly9-NH2[cycl 1→6],具有刺激子宫平滑肌收缩和促进乳汁分泌等功能,临床主要用于促进分娩和引产,也可用于防治产后出血。

缩宫素的制备方法主要有液相法和固相法。液相法存在废液产量大、反应时间长、后处理繁琐等不足 [2,3] 。固相合成法以一定的树脂为载体,在缩合体系作用下逐步偶联保护氨基酸,再经过裂解、氧化等步骤制备缩宫素 [4-6] 。文献报道将微波辐射与固相合成相结合得到缩宫素 [7] 。

本研究应用固相多肽合成法得到还原型缩宫素粗品,采用碘氧化法进行环化后,通过反相高效液相色谱法制备高纯度缩宫素,总收率34.0%。

️1.1 还原型缩宫素的固相合成

️1.1.1 Fmoc-Gly-Rink Amide树脂的制备

准确称取Rink Amide树脂(2 g,1 mmol)倒入反应柱中,加入DMF (20 ml)溶胀30 min,经DMF (20 ml×2)洗涤后加入20%哌啶的DMF溶液(20 ml)脱Fmoc保护2次,分别为5和10 min,中间用DMF (20 ml)洗涤1次。然后依次用DMF(20 ml×2)、DCM(20 ml)、DMF(20 ml×2)洗涤树脂(下同),经茚三酮试剂检测显阳性 [8] ,表明已脱除Fmoc保护基。将Fmoc-Gly-OH (0.892 g,3 mmol)、HBTU (1.14 g,3 mmol)和DIEA (0.6 ml,3 mmol)溶于DMF (10 ml)中,将此溶液加入到上述脱除Fmoc保护的树脂中,25℃反应1 h。茚三酮试剂检测显阴性,抽掉反应液,洗涤树脂。

️1.1.2 全保护还原型缩宫素肽树脂的制备

按照缩宫素的肽序列,重复“1.1.1”项下的脱Fmoc保护与氨基酸偶联步骤依次连接Fmoc-LeuOH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、FmocAsn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr (tBu)-OH和Fmoc-Cys (Trt)-OH,脱除N末端Cys的Fmoc保护基后,肽树脂经甲醇(20 ml)收缩2次,每次5 min,减压干燥至恒重,得还原型缩宫素肽树脂3.28 g。

️1.1.3 裂解与沉淀

将“1.1.2”项下的还原型缩宫素肽树脂放入100 ml反应瓶中,加入裂解试剂[三氟乙酸(TFA):1,2-乙二硫醇(EDT):水:三异丙基硅烷(TIS)(94:2.5:2.5:1),33 ml],0℃下反应30 min后,室温反应2 h,抽滤,用少量TFA洗涤树脂,合并滤液并缓慢加入到冰乙醚(300 ml)中沉降,离心后弃去上清液,将沉淀用冰乙醚洗涤(150 ml×3),减压干燥得还原型缩宫素粗品0.91 g。

️1.2 粗肽分析

HPLC分析条件:色谱柱Innoval C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相A:0.1%TFA水溶液,B:0.1%TFA乙腈溶液,洗脱梯度(0→20 min:B 5%→95%);流速1 ml/min;检测波长215 nm;柱温30℃[9]。还原型缩宫素粗肽纯度为74.5%,保留时间为8.59 min。

️1.3 二硫键的形成

将还原型缩宫素粗品(0.91 g)加入到超纯水(500 ml)中,再加入乙腈(5 ml)助溶,过滤得无色澄清溶液。向该溶液中缓慢滴加20 mg/ml碘的乙醇溶液(7 ml),溶液变为淡黄色,HPLC监控氧化进程,10 min反应基本完全。缓慢滴加饱和维生素C (Vc)水溶液(0.1 ml)除去过量的碘,反应体系由淡黄色变为无色时停止滴加,经0.45μm微孔滤膜过滤,40℃减压旋蒸浓缩,得到缩宫素粗品溶液。

️1.4 缩宫素的分离纯化

将缩宫素粗品用Newstyle型反相半制备高效液相色谱仪分离纯化:色谱柱Hedera ODS-2反相硅胶半制备柱(20 mm×250 mm,10μm);流动相A:1%TFA水溶液,B:乙腈,梯度洗脱(0→30 min:B 15%→30%);流速8 ml/min;检测波长215 nm。分段收集主峰,35℃减压浓缩除去乙腈,冷冻干燥后得缩宫素纯品0.346 g,纯度99%[HPLC归一化法:色谱柱Innoval C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相A:0.1%TFA水溶液,B:0.1%TFA乙腈溶液,梯度洗脱(0→20 min,B 10%→50%);流速1 ml/min;检测波长215 nm;柱温40℃ [7] ]。纯肽总收率/%=(纯肽实际质量/理论量)×100%=[346 mg×99%/(1 mmol×1007.2)]×100%=34.0%。

️1.5 缩宫素的结构确证

️1.5.1 与对照品比较

本研究制备的缩宫素纯品与市售品在HPLC谱图中主峰的保留时间均为11.07 min。

️1.5.2 质谱分析

缩宫素纯品的ESI-MS分析结果:分子离子峰为m/z 1 007.7[M+H]+,与其理论相对分子量1 007.2相近。

️1.6 影响因素和条件优化

️1.6.1 还原型缩宫素的固相合成

本试验采用Fmoc/tBu固相多肽合成法,以Rink Amide树脂为载体,HBTU/DIEA为缩合体系,逐步缩合氨基酸得到全保护还原型缩宫素肽树脂。试验中比较两种缩合体系HBTU/DIEA和DIC/HOBt对氨基酸偶联时间、肽树脂的增重率及粗肽纯度的影响,结果见表1。

尽管使用HBTU/DIEA体系得到的肽树脂要少于DIC/HOBt体系,但其偶联氨基酸的效率与得到粗肽的纯度均明显优于后者,因此本试验选择HBTU/DIEA体系作为氨基酸的偶联试剂。

表1 两种缩合体系的比较

️1.6.2 裂解试剂组成

针对合成中所用保护氨基酸的侧链保护基团有Trt和tBu,考察5种常用的裂解试剂。称取肽树脂0.1 g,加入相应裂解试剂室温搅拌反应2 h,裂解液滤除树脂后经乙醚沉降、清洗和减压干燥后得到相应粗肽。各种裂解试剂对粗肽纯度和相对收率的影响结果见表2。

根据表2结果,综合考虑还原型缩宫素粗肽的质量和纯度,确定最佳的裂解试剂配比为TFA:EDT:H2O:TIS(94:2.5:2.5:1)。

️1.6.3 二硫键的形成

多肽的二硫键主要是通过氧化半胱氨酸的巯基形成。还原型缩宫素常用的空气或H2O2氧化法反应时间较长,且纯化过程繁琐,收率低;微波促进还原型缩宫素在树脂上环化也见文献报道,该方法需要使用微波反应器等特殊设备。本试验使用碘的无水乙醇溶液环化还原型缩宫素,反应仅需10 min,过量的碘可用Vc除去。缩宫素粗品溶液直接经过滤、适当浓缩后即可进行RP-HPLC半制备纯化,后处理简便易行。

本试验采用Fmoc/tBu固相多肽合成法,以Rink Amide树脂为载体,HBTU/DIEA为缩合体系,逐步缩合氨基酸得到全保护还原型缩宫素肽树脂,经TFA:EDT:H2O:TIS (94:2.5:2.5:1)配比的裂解液裂解得到还原型缩宫素粗品,采用碘氧化法氧化半胱氨酸上的巯基形成一对二硫键得到缩宫素粗品,经半制备RP-HPLC纯化、冻干后得到缩宫素纯品,纯度为99%,总收率为34.0%。该方法操作周期较短、简便经济、总产率高,可以为缩宫素等含二硫键的多肽类药物的规模化制备提供参考。

表2 不同裂解试剂的比较

注:1)相对收率/%=[(粗肽重×纯度)/肽树脂重]×100%

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