Elabscience探索免疫世界的窗口-ELISpot技术详解

随着生物医学领域的发展，对于免疫系统功能的深入理解和精准测量变得越来越重要。酶联免疫斑点技术（ELISpot）作为一种高效技术手段，在这一过程中扮演了关键角色。通过ELISpot，研究人员能够️准确地定量分析单一免疫细胞分泌的细胞因子或其他分子，为免疫应答研究提供新的研究思路。

本期推文，Elabscience将带领大家走进ELISpot的世界，让我们一起揭开免疫反应背后的秘密吧！

️01 ELISpot技术简介

酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked ImmunoSpot Assay，ELISpot）是一种基于ELISA原理进行创新的细胞检测技术。ELISpot技术的历史可以追溯到1978年，当时牛津大学的Don Mason教授开发了一种“胶片上的斑点技术”，这种方法是用于检测抗体分泌细胞的早期尝试。而后，ELISpot在1983年由J.D. Sedgwick和C. Czerkinsky两位科学家分别独立发展起来，他们引入了酶联免疫的概念，并将其应用于斑点形成的技术中，使得这种技术更加实用，灵敏度更高[1, 2]。

ELISpot可检测单个细胞分泌细胞因子/抗体的能力，对样本中活细胞免疫状态进行动态监测评估。如图1所示，将细胞培养在包被了特异性捕获抗体的PVDF板中，细胞分泌的靶标蛋白被特异性包被抗体捕获，孵育适当时间后，去除细胞并加入生物素化抗体，通过酶促显色反应形成沉淀物，即“Spot”——“斑点”[3, 4]。

ELISpot具备高灵敏度、高通量筛选、活细胞功能评价、操作简单等技术优点，被广泛应用于️疫苗研究、药物筛选、感染性疾病诊断与研究[5]、肿瘤免疫研究[6]、自身免疫病研究、过敏研究、移植中排斥反应的预测等多个免疫相关研究中。

图1. ELISpot原理图（图源网络，侵删）

️02 ELISpot技术进阶版——FluoroSpot

FluoroSpot是在ELISpot的基础上发展的新技术，用荧光检测代替了比色法，将不同波长的荧光团混合在一起，通过滤光片即可实现多种细胞因子的精确检测[7]，既保留了ELISpot高灵敏度的特点，又可同时分析分泌不同细胞因子的多个细胞群体。以三色FluoroSpot为例[8]，96孔板的PVDF膜上同时包被IFN-γ、IL-17A、IL-22因子的捕获抗体，用不同发射波长的荧光素标记，生成不同颜色的荧光斑点可以通过FluoroSpot分析仪对三种因子分别进行斑点计数和数据分析。

图2. 三色FluoroSpot IFN-γ/IL-17A/IL-22荧光斑点试验示意图[8]

️03 ELISpot与ELISA对比

从技术本质上，ELISpot和ELISA都是基于双抗夹心法原理，但ELISA是对检测样本溶液中靶标蛋白浓度的定量测定，而ELISpot是对样本中活细胞免疫状态进行动态的检测评估。详细对比如下：

️表1. ELISpot与ELISA的区别

以上就是ELISpot的详细介绍，相信大家对ELISpot有了更加全面的认识。从其基本原理到实际应用，ELISpot以其独特的优势，在疫苗开发、肿瘤免疫治疗等多个方面展现出了巨大的潜力。随着科学技术的不断进步，相信ELISpot还将为人类健康事业做出更大贡献。

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参考文献：

[1] P.G.H. J D Sedgwick, A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells, J Immunol Methods 57(1-3) (1983) 301-9.

[2] L.A.N. C C Czerkinsky, H Nygren, O Ouchterlony, A Tarkowski, A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells, J Immunol Methods 65 (1983) 109-121.

[3] M. Faresjo, Enzyme linked immuno-spot; a useful tool in the search for elusive immune markers in common pediatric immunological diseases, Cells 1(2) (2012) 141-52.

[4] E. Girmanova, P. Hruba, O. Viklicky, A. Slavcev, ELISpot assay and prediction of organ transplant rejection, Int J Immunogenet 49(1) (2022) 39-45.

[5] C. Tincati, A.J. Cappione Iii, J.E. Snyder-Cappione, Distinguishing Latent from Active Mycobacterium tuberculosis Infection Using Elispot Assays: Looking Beyond Interferon-gamma, Cells 1(2) (2012) 89-99.

[6] A.M. Malyguine, S. Strobl, K. Dunham, M.R. Shurin, T.J. Sayers, ELISPOT Assay for Monitoring Cytotoxic T Lymphocytes (CTL) Activity in Cancer Vaccine Clinical Trials, Cells 1(2) (2012) 111-26.

[7] S. Janetzki, Immune monitoring technology primer: the enzyme-linked immunospot (Elispot) and Fluorospot assay, J Immunother Cancer 3 (2015) 30.

[8] T. Dillenbeck, E. Gelius, J. Fohlstedt, N. Ahlborg, Triple Cytokine FluoroSpot Analysis of Human Antigen-Specific IFN-gamma, IL-17A and IL-22 Responses, Cells 3(4) (2014) 1116-30.