Intan RHD2000TetrODrive： 用于组合电生理学和光生理学的开源微型驱动器

在四电极记录中，仅凭电生理特征很难确定记录单元的细胞类型。光标记（Optotagging）是一种克服这一难题的方法，即在电极顶端使用光源刺激，从基因识别的细胞中激发尖峰。然而，要记录许多不同的细胞，就需要用微型驱动器在大脑中缓慢推进电极和光源。我们设计的 TetrODrive 微型驱动器可以用廉价的台式树脂打印机进行 3D 打印，而且零件、组装时间和成本都极低。微型硬盘可在 15 分钟内组装完毕，包括 3D 打印机在内的所有材料的价格均低于单个商用微型硬盘。为了最大限度地提高记录稳定性，我们将驱动机制与电气和光学连接器进行了机械解耦。它能从光标记单元中提供高信噪比的记录，即使在不同的记录过程中也是如此。由于光纤可移动，我们的微型驱动器还可用于光纤光度测量。我们通过记录小鼠腹侧被盖区（VTA）的单个单元和钙信号来评估我们的微驱动器，并通过光标记确认细胞身份。因此，我们发现了不遵循经典奖赏预测误差模型的单元。TetrODrive 是一种用于小鼠光生理学的微型驱动器，体积小、重量轻、价格低廉。它的开放式设计、价格和内置特性可以大大扩展微驱动器在小鼠中的应用。

️ 一、简介

细胞外单元记录是以单细胞分辨率和高时间精度记录神经元信号的重要工具。通过插入大脑的金属电极记录的尖峰脉冲长期以来一直是我们了解许多脑区功能的关键指标，如海马、感觉皮层、深部脑核等。尽管有了高密度硅探针，而且其长期记录能力也有了最新进展，但四电极记录因其结构简单、记录质量高而仍然不可替代。在腹侧被盖区（VTA）、室上皮层或杏仁核等大脑深层结构中，多四电极记录与光导纤维相结合，得到了广泛应用。传统上，在急性实验中，电极被静态植入或安装在立体定向框架中，从而限制了单位产量和清醒记录。相比之下，头戴式微电极驱动器（microdrives）允许在清醒、头部固定或自由移动的动物体内进行记录，并可重新定位电极。

用于大鼠的系统通常可操控数十个独立电极。然而，在小鼠身上使用复杂的微驱动器却具有挑战性。小鼠的体重承载能力明显较小，只允许有限的微型驱动器尺寸，即使是几克的重量也已经严重限制了动物的活动能力。这种影响在幼年小鼠身上更加明显。此外，这种复杂的微型驱动器成本高、组装时间长。对于 TetrODrive，我们使用桌面 3D 打印技术实现了轻便、稳定的微型驱动器，只需几分钟就能组装完毕。

将光纤集成到微驱动器中有两大好处。首先，光遗传刺激可用于改变行为或操纵特定电路。其次，这种刺激可用于光标记，即通过光遗传激发尖峰来确认记录单元的细胞身份。这样就能对记录的细胞进行更精细的分类；基于遗传细胞身份，而不仅仅是波形和放电特征。如果使用低自荧光光纤，则可通过光纤光度计记录其顶端周围组织的荧光信号。在此，我们展示了通过内置在 TetrODrive 中的光纤进行的光纤测光记录。

一些集成光纤的小鼠微驱动设计设计复杂，组装过程耗时。使用光纤的小鼠单螺杆驱动设计更为简单。然而，3D 打印技术的进步允许快速生产和定制微驱动器。以前的 3D 打印单螺杆驱动设计占地面积大，纤维不可移动，或者组装过程中需要许多不同的部件，重量增加。

基于单螺杆微型驱动器的原理，TetrODrive 是一种新颖、可 3D 打印且易于组装的小鼠微型驱动器，它在轻质设计中结合了多达八个四极和一根可移动光纤。该设计是开放式的，并经过优化，可使用经济实惠的树脂桌面三维打印机进行三维打印。三维打印机本身的成本就低于单个商用微型驱动器。此外，我们的系统还解决了现有微驱动器的另一个问题：插拔力与电极的机械耦合。通过将光学和电气连接器与微驱动器本体分离，插拔不会对可移动电极和纤维产生影响。此外，我们还演示了在 VTA 中对已识别的单个单元进行长期记录、光标记以及光纤光度记录时使用微型驱动器的情况。

️ 二、研究材料与方法

️2.1 四极管

使用基于 Arduino 的扭线器（Open Ephys）将约 40 厘米长的钨丝（12.5 μm，HFV 绝缘层）扭成四极。用热风枪（温度：220 °C）从三面对扭转的导线进行热熔。这些四极中的八极被连接到带金针的定制电极接口板（EIB，设计文件在资料库中）上（Neuralynx）。使用一薄层硅胶作为保形涂层（3140 RTV 涂层，道康宁公司）。组装完成后，将组装好的微型驱动器的电极尖端放入无氰镀金溶液（31 g/l，SIFICO ASC）中，镀金至 150 kOhm（镀金电流：-0.015 μA，1 s，30 次，NanoZ，Multi Channel Systems）。

️2.2 光纤

使用了两种不同类型的光纤：用于光遗传刺激的普通二氧化硅光纤（100 μm 芯，0.22 NA，UM22-100，Thorlabs）和用于光纤光度测量的低自发荧光光纤（200 μm 芯，0.5 NA，FP200URT，Thorlabs）。使用紫外线胶水将光纤连接到陶瓷（光标记）或钢（光纤光度计）卡套（直径 1.25 毫米）上。光纤被插入带有凯夫拉纤维（FT900KY，Thorlabs）的细毛细管中。

️2.3 三维打印

TetrODrive 包含两个 3D 打印聚合物部件：主体（下部）和头部（上部）。TetrODrive 是在一台采用 LCD 技术的低成本桌面打印机（Photon，Anycubic）上打印出来的。该打印机通过紫外线（405 纳米）透射液晶面板（分辨率为 50 微米）来硬化连续的树脂层。层厚度为 50 微米。正常层的固化时间为 16 秒，六个底层的固化时间为 90 秒。这些部件正交印制在构建板上，并印制在薄支架上。在一次运行中（约两小时），打印机可以并行打印数十个微型驱动器部件。鉴于这些部件的设计，它们几乎可以在任何现有的树脂打印机上打印。不过，由于分辨率低，丝基（熔融沉积建模）打印机并不适用。如果当地没有打印机，可以使用在线 3D 打印服务，或者使用铣床。打印完成后，用异丙醇对零件进行短暂清洗（< 1 分钟）。限制在异丙醇中的停留时间非常重要，因为这有利于以后的应力开裂。使用压缩空气清除部件和孔中的残留液体。在 UVA 灯下对部件进行 15 分钟的后固化，然后在烤箱（50 °C）中加热两小时。设计文件、三维文件和完整的切片打印机文件可在 GitHub 存储库中获取。

️2.4 动物

所有动物实验均按照欧洲共同体（EUVD 6 86/609/EEC）的指导方针进行，并获得萨克森-安哈尔特州当地伦理委员会的批准。在结合经典巴甫洛夫条件反射进行电生理学和光标记时，我们使用了四只成年雌雄（15-25 g）半杂合子 C57/B6.SJL-Slc6a3tm1.1(cre)Bkmn/J x C57/B6.129S-Gt(ROSA)26Sortm32(CAG-COP4*H134R/EYFP)Hze/J 小鼠（杰克逊实验室，006660 Dat-Cre 与 012569 Ai32 杂交）。在这些动物中，Channelrhodopsin-2（ChR2）在多巴胺转运体的控制下表达，标记多巴胺能神经元。我们使用成年 Dat-Cre 小鼠（C57/B6.SJL-Slc6a3tm1.1(cre)Bkmn/J）进行纤维光度测定。所有动物均在十二小时光/暗循环下饲养（早上 6:00 开灯）。除训练期间每天限制饮水量为 1 毫升外，其余时间均自由进食和饮水，体重保持在初始值的 85% 左右。

️2.5 植入微型驱动器

用 3% 异氟醚在空气中蒸发诱导麻醉，然后腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）。手术部位注射盐酸布比卡因（0.25%，0.2 毫升）进行局部麻醉。小鼠接受立体定向手术，将 TetrODrive 植入左侧 VTA（AP：3.5 毫米，ML：-0.5 毫米，DV：3.9 毫米）。微型驱动器在开颅小窗口（直径小于 500 μm）内缓慢下降（一分钟内下降 100 μm），直至到达最终位置。然后，在插入部位周围涂上硅胶保护层，并用牙科粘合剂形成头盖。植入两颗颅骨螺钉以保持稳定，并在牙科丙烯酸中嵌入定制的头板。两个参考电极（氯化银线）被放置在微型驱动器插入部位的旁边，两根银接地线被植入枕叶上方。将 EIB 固定在微驱动器旁边，使其与微驱动器本体机械脱钩，并允许插入电气和光学连接器，而不会弯曲驱动器机构，也不会对电极或光纤造成潜在干扰。涂抹牙科粘合剂直至覆盖微型硬盘下部的大部分。注意避免牙科粘合剂接触到金属套管或螺钉，因为这样会妨碍电极的正常移动。在微驱动装置、四极导线和 EIB 上缠上 Parafilm® 用于保护。我们发现，在小鼠身上，这是比 3D 打印外壳更合适的轻型替代品。体型较大的啮齿动物可能需要更坚固的外壳来保护头部安装的部件。动物至少恢复了一周。

️2.6 纤维光度测定

如上所述，小鼠接受了外科手术。在插入微型驱动器之前，我们将携带荧光钙指示剂 GCaMP6f 的腺相关病毒（AAV.Syn.Flex.GCaMP6f.WPRE.SV40，1E13 粒子/毫升，Addgene）600 毫升注入左侧 VTA（AP：-3.5 毫米，ML：-0.5 毫米，DV：4.2 毫米）。指标表达三周后开始进行纤维光度记录。记录时，将小鼠置于调节装置中，并将定制的预漂白低自荧光光纤电缆连接到套圈上。GCaMP6 的激发光由 FiberOptoMeter（NPI Electronic）产生，该仪器还能测量返回的荧光。使用波形发生器（DG4102，Rigol）对激发光进行 66 Hz 正弦波调制，并使用锁定放大器（SR510，Stanford Research Systems）对荧光信号进行解调，以消除环境光的变化。产生的 GCaMP6 信号通过生物信号记录系统（RHD2000，Intan Technologies）以 1 kSp/s 的速度数字化，并在 MATLAB（The MathWorks）中进行分析。对信号进行去趋势处理，并使用相位中性的 20 毫秒滑动平均滤波器进行滤波，以去除高频噪声。荧光的计算公式为 ΔF/F，其中 F 表示试验前的平均基线荧光（试验开始前 1 秒），ΔF 表示该静息光强度与当前信号之间的差值。

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️2.7 电生理记录和尖峰分类

头固定小鼠的宽带信号（0.1 -20 kHz，30 kS s-1）通过 RHD 记录系统（RHD2132 头台，Intan Technologies）在消声和电屏蔽室中记录。使用 Kilosort2进行模板匹配，对尖峰进行检测和分类。我们使用 Kilosort2 的默认配置参数，但高通滤波和尖峰检测阈值除外，前者改为 600 Hz，后者降低了一半。不良通道被手动移除。使用基于 python- 的电生理数据图形用户界面对排序的尖峰数据进行手动整理。

️ 三、研究结果

️3.1 TetrODrive 的组装

TetrODrive 仅由两个 3D 打印部件组成，组装大约需要 15 分钟（图 1(a)）。该过程需要以下步骤：用 0.8 毫米的钻头将打印的微型驱动器主体中间的孔扩大，然后攻丝 M1×0.25 螺纹（图 1(b)）。攻丝时必须小心，以免破坏脆弱的螺纹。应反复取出钻头，清除丝锥上形成的树脂碎屑。必须用 1 毫米的钻头将插管固定在体内的两个孔完全扩开，以实现精确的滑动运动（图 1(b)）。最好用一根后来使用过的插管来测试钻孔效果，以确保动作顺畅。所有的钻孔都应该用手完成，一只手握住钻头，夹在一个小型手动钳中，另一只手握住微型驱动部分。

图 1 TetrODrive 的组装和装载。(a) TetrODrive 仅由两个 3D 打印部件、一个螺钉、一个螺母和两个钢套管组成。简单的结构使其能够在 15 分钟内完成组装和装载。(b) 在主体部分钻孔以安装 1 毫米尺寸的插管，并为螺钉切割螺纹。(c) 微型驱动头上的孔也被放大。(d) 用胶水将螺母固定在螺杆上，然后从底部插入插管。(e) 将微驱动头连接到主体上，然后转动几圈螺杆。(f) 用于纤维和四极杆的导向套管粘在头部，支撑套管粘在主体部分。四极杆和纤维粘在微型驱动器头部的突起上。用胶水将四极杆固定在光纤上。用锋利的硬质合金尖头剪刀将四极杆剪成一定长度，然后镀金。(g) TetrODrive 的尺寸。螺钉的长度决定了背腹移动距离。(h) TetrODrive 植入小鼠的示意图。微型驱动装置的整个主体部分和 EIB 下端嵌入牙科粘合剂中，但彼此机械隔离。

将带有导向套管和支撑套管的微型驱动器头插入微型驱动器主体，然后小心地将螺钉在微型 驱动器主体内转动几圈，将两个组件连接起来（图 1(e)）。现在必须使用少量紫外线胶水将支撑套管固定在微型驱动器体内，将导向套管固定在微型驱动器头部（图 1(f)，胶水步骤 1+2）。这样，固定在头部的导向套管就可以通过固定的主体支撑套管上下移动。转动螺钉，从而上下移动头部，确认装配正确。支撑套管孔和螺纹孔的底部应用胶带封住，以防手术过程中液体或胶水渗入。微型驱动器的尺寸和重量较轻，专为小鼠（包括本研究中使用的幼鼠）设计（图 1(g)、(h)）。

️3.2 四极管和纤维加载

将与 EIB 相连的四极杆插入导向套管，直至其从微驱动器主体下侧突出几毫米，超出计划的初始植入深度（图 1(f)）。应注意不要损坏四极管的绝缘层。装入四极管后，将光纤插入导向套管，直至其突出到计划的初始植入深度。然后用紫外线胶水将光纤和四极固定在微驱动头的导向套管上（图 1(f)，胶水步骤 3）。突出的电极用紫外线胶粘在光纤上，然后用硬质合金尖头剪刀剪成一定长度（普通钢剪刀太软，可能导致四极性能不佳、短路和涂层交联，图 1（f），胶水步骤 4）。我们将纤维与电极尖端之间的距离保持在 300 至 500 微米之间。理想情况下，四极应等距分布在光纤尖端周围，而不是集中在一处。紫外线胶水不能接触到光纤尖端，而且只需少量，以保持较低的植入直径。最后一步是将光纤末端的套圈粘到 EIB 背面（图 1(f)）。组装好的微型驱动器现在可以进行四极电镀、消毒和植入。TetrODrive 和 EIB 的设计文件可在资料库中查阅。

️3.3 慢性单细胞记录

我们通过植入 VTA 的四极杆记录单个单元。以 Kilosort2 排序的示例单元见图 2(a)。自相关图显示了一个清晰的折射期，而交叉相关图则没有共同的折射期（图 2(b)）。每个四极管和记录时段（n= 3 只动物，7 个时段）平均发现 5 ± 1 个（平均 ± SEM）分离良好的单元。可记录多个单元达数周之久，尤其是在四极连续推进的情况下（图 2(c)）。为了测试在电极未移动的情况下的长期记录质量，我们在一个微型驱动器六周未移动、植入十周的制备物中进行了记录。即使在这种情况下，我们仍然发现了清晰的单个单元，显示出振幅在毫伏范围内的高信噪比尖峰（图 2 (d)）。我们发现，如果单元丢失，将四极管尖端向前移动约 100 μm（1/2 圈）后，下一次记录中会出现许多新单元（图 2（e））。我们发现，在记录前一天将电极前移，让电极头沉淀下来是有好处的。特别是由于玻璃纤维相对较厚，组织移动可能需要一些时间。不过，这个沉淀期可能因植入深度、纤维厚度和感兴趣的结构而异，应根据每种制备方法通过实验确定。

图 2.有微动装置运动和无微动装置运动的慢性单个单元记录 (a) 示例，来自两个四极杆的带通滤波信号。单元尖峰用颜色标记。(b) 单元质量。只有低 L 比率和足够隔离距离（iso. 每个单元的自相关（ACG）和单元间的交叉相关（CCG）（植入后 38 天）显示了单元分离情况。(c）来自同一四极管的两个通道随时间变化的峰值振幅。在四个不同的时间点，通过微驱动器在两次记录之间的移动来区分单元。(d) 在一个位置 42 天后（术后 72 天），在没有微驱动运动的情况下剩余的单个单元示例。(e）在一个位置长时间（1 个单位/3 个四极杆）未显示活跃单位的四极杆可通过转动微驱动螺钉重新激活（7 个单位/3 个四极杆）。(n=3)

️3.4 单个单元的稳定性和深度微调

所用螺钉的细螺纹和机械解耦使电极尖端可在脑内精确移动，并可抵御堵塞力。图 3(a) 显示了与图 2(b) 相同的来自两个四极杆的两个单元，但显示了它们在记录过程和驱动运动中的变化。螺钉旋转 180°（> 125 μm）会产生新的单个单元组（图 3(a)，位置 1，记录 1 - 位置 2，记录 2；位置 3，记录 6 - 位置 4，记录 7）。在连续 5 次录音中，这些单元都可以被跟踪（图 3（a），记录 2 - 记录 6，r> 0.9）。例如，单元 B 显示出较高的时段内和时段间振幅稳定性（图 3（c），记录 3 - 4，位置 2）。稳定的尖峰间期变异系数（Cv）是衡量记录过程中单元稳定性的另一个指标（如单元 B1-5 和 E1-5，图 3(a)）。这些结果表明，TetrODrive 可用于记录多天内的稳定单元，即使光纤被多次插拔。

图 3：TetrODrive 的精确驱动机制。(a) 两个四极杆的两个示例单元在连续记录过程（rec.）中的单个单元稳定性以及微驱动器移动导致的单元变化。四个不同位置的示例单元的主成分 1 和 2 (PC) 以及平均波形（与前一个记录的类似单元在 5 个记录时段的交叉相关性）。从位置 1 到位置 2 的深度调整超过 125 μm（粗调）后，获得了新的单元。位置 2 的单元在连续三次记录过程中保持稳定。位置 4 的深度调整超过 125 μm（粗转）后，又获得了新的单元。(b) 微驱动器细转（90°）导致单元 D 和单元 E 的 PC 1 和 PC 2 漂移。(c) B 单元连续三次（第 3 至第 5 次记录）的尖峰振幅。微调导致最佳通道的尖峰振幅略有偏移。(n=1)

微调螺钉的角度不超过 90°（< 60 μm，位置 2，记录 4 - 位置 3，记录 5），电极的移动很小，因此大多数单元仍可跟踪，只是平均波形略有偏移（图 3(a)）。大多数单元的波形相关性在 5 天内都保持在 r>0.9 以上（记录 2 - 记录 6）。D 单元的变化（r>0.8，PC 分量的移动，图 3(b)，D 单元上面板）和 B 单元振幅的变化（图 3(c)，位置 2，记录 4 - 位置 3，记录 5）证明了尖端确实发生了移动。在单元 E 中，PC 成分的变化更为细微，仅在 PC 2 中观察到（图 3(b)，下图）。这些结果表明，TetrODrive 足够稳定，可在数天内保持单元，但也能精确移动，以便在组织中进行精细、连续的移动，这在发现光致反应神经元并需要跟踪时很有帮助。

️3.5 多巴胺能中脑神经元的光遗传鉴定

在此，我们展示了 TetrODrive 在巴甫洛夫条件反射过程中在 VTA 中执行慢性光标记的能力。我们在多巴胺能细胞中表达了 ChR2（图 4(e)），并用蓝色激光脉冲对这些细胞进行光刺激。在多巴胺能细胞中，这种刺激会在光启动后导致单个短时程尖峰（图 4(a)）。从特征上看，这类神经元只能跟随较低的刺激频率（图 4(b)）。我们绘制了平均自发波形（图 4(c)，黑色波形）和平均光诱导波形（图 4(c)，蓝色波形）与光诱导电压响应之间的相关关系图，显示了响应（蓝色）和非响应（灰色）单元（图 4(d)）。有趣的是，我们观察到一些单元在巴甫洛夫条件反射前后对激光脉冲的反应潜伏期发生了变化（单元 1，图 4(c)）。经鉴定的多巴胺能单元的平均发射率为 4.8 Hz（范围：1.9 - 9.4 Hz）。平均峰宽为 151.6 μs（范围：81.2 - 261.30 μs，全宽半最大值）。在至少有一个确认的多巴胺能单元的环节中，光遗传无反应的单个单元的平均发射率较高，为 24.9 Hz（范围：0.5 - 71.7 Hz），但平均峰宽相似，为 150.5 μs（范围：81.8 - 401.45 μs）。

图 4.识别 VTA 中的多巴胺能神经元 (a) 连续带通滤波信号。短光脉冲（蓝色方框，5 毫秒）引起单个锁定时间的光诱发尖峰。(b）光标记神经元对 5、10 和 20 Hz 光刺激的反应。黑点代表一个尖峰；蓝色方格代表一个光脉冲。(c）调节前后自发尖峰波形（黑色）与光诱发波形（蓝色）的相关性。调节前后激光起始点（0 毫秒）周围的尖峰光栅图。在调节过程中，已识别单元的起始潜伏期发生了变化。(d）自发波形和光诱发波形与光诱发尖峰能量的交叉相关性。(e）VTA 中纤维和四极管位置的组织学切片示例（绿色：Dat 特异性 ChR2-eYFP 表达）。比例尺=200μm，（n=4）

️3.6 中脑多巴胺能神经元的奖赏预测误差

根据之前的工作，我们记录了 VTA 中对预期和意外 US 的反应变化。对同一多巴胺能单个单元连续四次调节过程的记录显示，对 CS 的反应强度增加，但对预期 US 的反应强度变化更大（图 5(a)）。在出现未预测的 US 后，多巴胺能神经元反应强烈（图 5(b)）。省略预测的 US 会导致预期 US 出现时的发射率下降，这在光栅图中观察到（图 5(c)）。我们普遍观察到已识别的多巴胺能单元反应的高度多样性，一些单元对US、CS或两者都有强烈反应，即使在延长条件反射后也是如此（图5（d）、（f））。尽管观察到多巴胺能单位的反应具有多样性，但总体而言，我们观察到在条件反射过程中，反应强度从 US 转向 CS（图 5(e)，r = 0.66，P<0.001）。CS 反应的增加（r = 0.52，P<0.01）不如 US 反应的减少（r = 0.28，P=0.17，图 5(f)）明显。

图 5.巴甫洛夫条件反射过程中多巴胺奖赏预测错误。(a-f）光标记多巴胺神经元的单细胞记录（n=3）。(g-k）通过纤维光度法进行基因编码的多巴胺能大量荧光（n=1）。(a) 一个典型多巴胺能单元在连续三个疗程中的平均疗程反应。对 CS 的反应随着时间的推移而增加，而对 US 的反应则没有消失。(b) 在未预测的 US 之后，可以看到正奖励预测误差反应。(c) 经过大量训练后，细胞对 CS 音做出反应，但在出现遗漏的 US 时会出现负奖励预测错误。(d）多巴胺能单元在两次后期行为训练中的平均反应。(e）行为训练中多巴胺能单元的 CS-US 比率。(f) 多巴胺能单位在 CS 和 US 时的平均会话反应发射率（减去基线活动）与行为会话的函数关系。(g) 调整纤维尖端位置可用于优化纤维光度测量信号幅度。(h) 受训动物在未预测 US 的试验中的正奖励预测误差。(i) 训练动物对 CS 和 US 的反应。(j) 受过训练的动物在有 CS 但没有 US 的试验中的负奖励预测误差。(k) 对两个中性线索的反应。

️ 四、讨论

在此，我们介绍一种用于小鼠电生理学和光生理学联合研究的新型 3D 打印微型驱动器。它几乎可以在任何实验室以极低的成本用很少的零件制造出来，结构紧凑，重量轻，所有连接器都与可移动的微驱动器部件机械解耦。可移动光纤可进行光遗传刺激和光纤光度测量。所有设计资源均可公开获取。

较大的啮齿类动物可以植入相对较大的微驱动器，因此，大多数现有设计都以大鼠而非小鼠为目标。对于小鼠来说，微驱动器的数量较少，但迄今为止还没有一种微驱动器结合了 TetrODrive 的功能。通常情况下，支持光遗传学的 3D 打印小鼠微驱动器分为两类：A）大型、复杂、重型微驱动器，可单独操控每个电极。对于需要所有电极都瞄准相对较薄的细胞层（如海马）的实验方法来说，它们具有优势；B）简单微驱动器体积较小，不允许单独操控电极，通常缺乏可移动纤维。简单微驱动器设计的复杂性和重量会随着可移动纤维的加入而增加（例如，可达 4.4 克），从而限制了与幼鼠的合作。因此，其他简单的设计只包括静态纤维。TetrODrive 是首个 3D 打印的简易设计多四极微驱动器，带有可移动的光纤，由单个螺钉驱动，重量轻（0.5 克）。

将光纤集成到微驱动器中可能会带来另一个问题：光纤连接器通常直接连接到组件的驱动部分，在插拔周期中会将机械力耦合到电极尖端。人们已经认识到这一问题，并针对无光纤微驱动器和硅探针微驱动器开发了解决方案。TetrODrive 的设计、分体式驱动机制和连接器，从本质上避免了电极和光纤上的插拔力耦合。为了进一步减少力，我们使用了零插入力连接器，在这种连接器中，几乎没有净插入力施加到头部。因此，我们可以连续多次记录相同的光标记单元，而之前的研究在每次记录后都会更换电极。

我们的微型驱动器不具备可单独移动的四极。这可能会限制其在海马等需要将多个四极定位在薄细胞层的制备中的实用性。我们有意识地做出这一选择，以降低微驱动器及其组装过程的复杂性。带有可单独移动电极的微型驱动器组装起来可能需要数天时间，而我们的设计只需 15 分钟即可完成。在不需要单个电极之间相对运动的脑区，就没有必要投入这么多时间，也没有必要让动物承担多余的重量和体积。

为了证明 TetrODrive 的多功能性，我们将其用于 VTA 的记录、光标记和纤维光度测量。VTA 是一个与奖赏处理密切相关的脑区，但却显示出功能多样的多巴胺能活动模式。它由不同的神经元亚群组成，这使得光标记而不是电生理标记成为可靠识别记录单元的必要条件。

总体而言，我们的数据与奖励预测误差理论一致。对预期 US 的反应逐渐减弱，而对 CS 的反应则逐渐增强。然而，我们观察到已识别的多巴胺能单元的反应并不均匀。根据之前的观察结果，即使在条件反射之后，许多单元仍然对 US 有强烈的反应。这一发现可以用影响发射的感觉或运动过程来解释。对美国持续反应的第二个解释可能是奖励预测错误编码与长资格追踪。

与之前的微驱动器不同，我们的设计还允许通过可移动纤维进行纤维光度测量和记录位置优化。在我们从 VTA 多巴胺能细胞记录的群体钙信号中，我们观察到了奖赏预测错误编码的一些特征，如对 CS 的反应和对遗漏 US 的反应减弱。同样，即使在长时间的条件反射后，我们也没有发现对预期 US 的反应停止。然而，纤维光度法和电生理学的结合首次证明了这一特性是 VTA 在群体水平上的特征，但并不存在于所有的单个单元中。因此，纤维光度测量的结果不应被视为代表某一特定区域的所有单元，而应谨慎解释。

通过整合远程驱动机制，TetrODrive 的未来迭代可以得到改进。利用微型电机或压电晶体，微型驱动装置可以屏蔽所有外部机械力。这可能有助于进一步提高装置的稳定性。我们已经部分测试过的其他发展途径是进一步微型化微型驱动器。由于微型驱动器结构简单，而且使用现成的部件，因此可以使用更小的螺钉和插管，以节省更多的重量和体积。目前，每只小鼠大约可以使用两个微型驱动器，尤其是在微型驱动器之间共用 EIB 的情况下。如果采用更小的设计，则可以安装更多微型驱动器。

️ 五、研究结论

TetrODrive 是一种可 3D 打印、易于组装且开放的微驱动器设计，它将光生理学和电生理学结合在一起。它将简单的设计和先进的性能独特地结合在一起，为更多实验室提供了小鼠微驱动器。通过将电生理学和光生理学相结合，它还弥补了传统单元记录和遗传方法（如光遗传学和光纤光度法）之间的差距。

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