大规模制备奥曲肽

摘要：优化并放大了奥曲肽的合成技术。通过提高反应温度到40℃和选择弱极性溶剂二氯甲烷, 将Fmoc-Thr (tBu) -O l与2-氯三苯甲基氯树脂的取代度提高到0.503 mmol/g。采用w (H2O2) =30%的水溶液合成二硫键, 简化了分离氧化剂的步骤。自制10 g级大规模反应器, 集成过滤、搅拌、控温、鼓泡四重功能, 且操作方便。合成规模被放大到10 g水平, 奥曲肽的产率从31.8%提高到48.7%, 合成成本从1 000元/g降低为359元/g。

️关键词： 大规模 奥曲肽 反应器 多肽合成 精细化工中间体

奥曲肽 (octreotide) 是美国FDA于1988年批准上市的多肽类药物, 为分子内含有一个二硫键的环八肽 [1] , 它对多种疾病及肿瘤有确切治疗效果 [2] 。奥曲肽的合成主要采用固相方法。刘作家 [3] 等采用对羧基苯甲醛方法合成奥曲肽, 总收率为30%, 产量为0.025 4 g;Margret Schottelius [4] 等采用DHP树脂, 可以直接将氨基醇与树脂连接, 减少了操作步骤, 但是该树脂价格昂贵 (53 元/g) , 树脂占合成成本50%以上, 无法进行工业应用; Yasushi Arano [5] 等采用2-氯三苯甲基氯树脂可直接将氨基醇与树脂连接, 合成方法简便, 树脂价格便宜, 但是氨基醇与树脂连接率很低 (0.287 mmol/g) , 产率为31.8%, 产量仅为0.025 g。采用以上方法合成奥曲肽产量、产率均较低, 合成成本高于1 000 元/g, 不符合大规模制备奥曲肽的需要, 不能满足日益增长的多肽市场需求。

本研究采用图1所示的合成路线, 提高氨基醇与树脂的连接效率, 研究高效、经济的奥曲肽合成工艺。并自制10 g级大规模多肽合成反应器, 集成了过滤、搅拌、控温、鼓泡四重功能, 且操作方便。在此反应器中, 探索奥曲肽的大规模制备技术, 以期提高合成产率和效率, 降低合成成本, 同时也为其他多肽的合成、放大提供了参考。

图1 奥曲肽合成路线图

️1.1 奥曲肽的合成

奥曲肽的合成按照连接第一个氨基酸与树脂、按序列逐步缩合后续氨基酸、切割、环化的路线, 合成规模从毫克级到10 g级逐步放大。

️1.1.1 Fmoc-Thr (tBu) -Ol与CTC resin的连接

取0.5 g CTC resin置于反应器中, 加入10 mL DCM, 溶胀30 min, 过滤。在一个三角瓶中加入0.6 mmol Fmoc-Thr (tBu) -Ol、 5 mL DCM及1.2 mmol DIEA (二异丙基乙胺) , 混合均匀后倒入树脂中, 40 ℃反应2 h。反应结束后过滤, 用3 mL DCM洗涤树脂3遍, 真空干燥。取12.1 mg 树脂, 加入2 mL V (PIP) ∶V (DMF) =1∶4, 反应10 min, 收集滤液。取2 mL用甲醇稀释500倍的V (PIP) ∶V (DMF) =1∶4的溶液为空白，测得用甲醇稀释500倍的滤液在301 nm处的紫外吸收为0.620, 计算得树脂取代度为0.503 mmol/g [6] 。

️1.1.2 肽链的延长

在上述树脂中加入2 mL V (PIP) ∶V (DMF) =1∶4, 反应10 min, 过滤, 加入3 mL DMF洗涤树脂3次。按照n (氨基酸) ∶n (DIC) ∶n (HOBt) ∶n (CTC resin) =3∶3∶3∶1, 溶剂为4 mL DMF, 从C端开始, 依次连接余下7个氨基酸, 合成目标肽 [7] 。

️1.1.3 肽链的切割

将所得肽-树脂置于砂芯反应器中, 加入10 mL切割试剂 (0.25 mL水, 0.25 mL TIS, 9.5 mL TFA) , 反应2 h。然后过滤, 旋转蒸发浓缩滤液。在浓缩液中加入100 mL冰乙醚, 析出沉淀。在5 000 r/min转速下离心10 min, 弃去上清液, 真空干燥沉淀得0.301 g粗肽。

️1.1.4 还原型奥曲肽的氧化成环

将前述所得还原型奥曲肽溶于50 mL V (H2O) ∶V (ACN) =1∶9的溶液中, 加氨水调pH=8.03, 室温磁力搅拌下缓慢加入0.15 mL w (H2O2) =30%的双氧水, 每30 min取样, 用HPLC分析, 分析条件为:色谱柱:Cromasil C18分析柱 (5 μm, 4.6 mm×250 mm) ;流动相A为甲醇, B为φ (TFA) =0.1%的水溶液;流速1 mL·min-1;洗脱梯度为:0～20 min, B与A的体积比从75%线性变化为0, 然后维持5 min;检测波长:215 nm;进样量:20 μL;室温。反应结束后, 加入乙酸调pH=4.0以终止氧化反应。与标准品对照, 计算产率。

️1.1.5 合成工艺的放大

采用自己研制的多肽大规模合成反应器 (见图2) , 沿用以上毫克级的合成方案, 树脂投料加大为10 g, 其他试剂投料按比例依次放大, 合成奥曲肽。

图2 奥曲肽大规模合成反应器

1—N2鼓泡;2—机械搅拌;3—砂芯过滤;4—水浴夹套

️2.1 Fmoc-Thr (tBu) -Ol与CTC resin的连接

此步为合成奥曲肽的第1步, 其连接效率的高低直接决定了树脂的利用率及产物的产率。而氨基醇与CTC resin的连接相对较难, 本工作通过对反应温度和反应溶剂的选择来提高连接效率, 结果见表1。

表1表明, 采用弱极性溶剂DCM, 提高反应温度为40℃, 树脂取代度可从0.287 mmol/g提高到0.503 mmol/g, 且反应时间不到原来的十分之一, 极大提高了反应效率。

️2.2 还原型奥曲肽的氧化

还原型奥曲肽的氧化进程如图3所示。

图3 还原型奥曲肽氧化进程

从图3可知, 反应0.5 h氧化已经接近完全;1.5 h后奥曲肽的峰面积达到最大, 反应进行完全。采用w (H2O2) =30%的双氧水作氧化剂, 相对于空气氧化需要十几个小时甚至几天的反应时间 [8] , 本法反应快速, 提高了反应的效率。与以DMSO [9] 为氧化剂相比, 后处理简单, 只需冻干即可实现氧化剂与多肽的分离。与采用I2 [5] 作为氧化剂相比较, 无需加入维生素C, 仅需调节pH就可防止过氧化产生副产物, 避免了引入杂质维生素C而给分离带来的困难。

️2.3 奥曲肽大规模合成结果

自制大规模多肽反应器的底部一改传统的直筒状, 设计为圆弧形, 减少了反应死角。采用N2鼓泡和机械搅拌相结合的方式以提高传质效率, 同时N2气氛又可避免由空气引起的氧化等副反应的发生。反应器底部设计有三通, 既可以通N2, 又可外接水泵以便抽滤。上部留有两口, 一个加料, 一个搅拌。反应腔体为双层, 两层之间可以通过水浴加热或冷却, 保持恒温。此反应器集成了过滤、搅拌、控温、鼓泡四重功能, 操作方便。采用此反应器大规模合成奥曲肽, 合成结果与小试比较见表2。

可以看出, 采用作者设计的反应器合成奥曲肽, 产率和成本基本达到小试水平, 成功实现了奥曲肽的放大制备。以此反应器合成奥曲肽, 大规模合成产率接近50%, 大大高于文献31.8%的产率;而合成成本为359 元/g, 降低合成成本约三分之二, 具有良好的应用价值。

成功提供了一条大规模、高产率、低成本的奥曲肽合成工艺及反应器设备。自制10 g级大规模多肽合成反应器, 集过滤、搅拌、控温、鼓泡四重功能于一体, 操作方便, 将合成产率从文献[3, 5]报道的30%提高到50%左右, 降低了合成成本约三分之二。此工艺及设备也适用于其他肽的放大合成。

使用弱极性溶剂DCM, 升高反应温度到40 ℃, 反应仅2 h, 即可将Fmoc-Thr (tBu) -Ol与CTC resin的连接率提高到0.503 mmol/g, 大大提高了反应的效率及树脂的利用率, 降低了成本。

采用w (H2O2) =30%双氧水作氧化剂氧化成环, 将反应时间缩短为1.5 h, 不引入其他杂质, 减轻了后续分离的压力。

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