Intan RHD2132对内侧隔副发光素阳性细胞进行光遗传起搏会干扰网格细胞的时间发射，但不会干扰空间发射

内侧内侧皮层（MEC）中的网格细胞表现出显著的空间活动模式，其尖峰由内侧隔区（MSA）驱动的θ振荡协调。栅格细胞的尖峰相对于θ相位的进展称为相位前冲，这种现象被认为是形成栅格细胞空间周期性的关键。在这里，我们展示了光遗传激活 MSA 中的副发光素阳性（PV+）细胞能使 MEC 中的局部场电位（LFP）振荡发生选择性起搏。在光遗传刺激过程中，网格细胞被锁定在施加的起搏频率上，但保持其空间模式。相位前冲被取消，速度信息不再反映在 LFP 振荡中，但仍由单个 MEC 神经元的速率编码传递。这些结果共同证明，θ振荡对网格细胞的空间模式并不重要，也不携带关键的速度信号。

️ 一、简介

内侧脑皮层（MEC）表达多种空间调制细胞类型。其中，网格细胞以特征性的六边形活动模式代表环境。网格细胞具有规则的间距、方向和相位，被认为有助于根据自我运动线索进行导航。网格细胞形成独特的模块，具有相似的间距和方向。这种群体活动在不同环境中具有一致性，这有力地表明网格表征并非由单个神经元计算产生，而是来自一个连续吸引子网络（CAN）。值得注意的是，单个网格细胞并不直接相连，而是通过密集的抑制性神经元网络进行交流，这支持了网格细胞通过由潜在网络连接决定的自组织原则产生的观点。然而，网格细胞如何支持自我定位还存在很大争议，一个著名的假说建立在振荡干扰（OI）的概念之上。

有人提出，有节奏的神经活动对于同步活动以实现有效的群体编码至关重要。θ频率范围（6-10赫兹）的振荡在与环境接触的动物的颞叶内侧（包括颞叶内侧EC）尤为突出。θ活动被认为在记忆处理过程中发挥作用，因为海马和内侧皮层中的网格细胞和位置细胞序列一直受到θ活动的调节，这可能会促进可塑性并加强神经集合内的连接。在内侧皮层，这可以在浅层（LII 和 III）的网格细胞亚群中观察到，这些细胞会出现相位前移，当动物穿越网格区域时，尖峰会逐渐提前落在θ周期中。相位前冲最早出现在海马位置细胞中，被认为是序列学习的促进机制和空间信息处理的重要组成部分。

MEC 中的 Theta 振荡与内侧隔和布罗卡对角带的节律活动有关，它们共同构成了内侧隔区（MSA）。MSA 包含多种驱动起搏活动的细胞类型，起搏活动通过谷氨酸能、胆碱能和 GABA 能神经元的投射传递到 MEC。MSA 的病变或药理失活会破坏 MEC 中的 theta 振荡并损害网格细胞的活动，这表明 theta 在网格细胞活动中起着偶然的作用。然而，MSA 失活会影响所有下游区域，而不仅仅是向 MEC 的投射。因此，在自由运动的动物中，仍缺乏直接证据证明 MSA 驱动的 Theta 振荡与网格细胞点燃有关。

为了建立可以解释网格细胞活动如何产生的计算模型，人们已经做出了一些努力。在一个著名的模型中，θ 振荡和相位前移之间的关系被认为是通过 OI 形成网格细胞空间表征的基础。然而，这种单细胞模型排除了网格细胞中明显的群体表征，而基于 CAN 的网格细胞模型则包含了群体表征。最近，OI 模型与 CAN 模型合并为所谓的混合模型，其中包括群体表征和相位前移。当这些模型结合在一起时，就能分别解释由 CANs 和 OI 模型预测的膜电位斜坡和相位前移。要将神经活动映射到稳定的空间表征，需要某种形式的路径整合。网格细胞模型之间的主要分歧之一在于如何对位置进行编码、更新和解码。在混合模型中，路径整合是通过相位前移完成的，相位前移由速度控制振荡器和基线振荡之间的相位差给出，基线振荡通常被认为是由 MSA 输入驱动的。因此，该模型预测相位前冲与网格细胞空间表征之间存在因果关系，但这仍有待检验。

MSA投射的GABA能部分主要终止于MEC的抑制性中间神经元，并被认为是通过协调MEC和海马的局部抑制性回路而产生节律性活动的主要因素。为了验证相位前驱是网格细胞路径整合的基础这一预测，我们使用光遗传学方法扰乱了MSA输入，从而破坏了MEC的内源性θ（6-10 Hz，包含功率谱密度（PSD）的峰值）和相位前驱。我们假设，通过解除抑制控制栅格细胞的尖峰活动，从而将尖峰相位关系锁定在刺激频率上，相位前冲也会随之消失。我们利用大鼠 PvalbCre 系的 Cre-Lox 系统，将扰动限制在 MSA 投射的 GABA 能部分。这使我们能够选择性地靶向表达parvalbumin（PV）的抑制性细胞类型，PV是MSA中主要的GABA能细胞类型。为了测试相位前移与路径整合之间的关系，我们选择了 11 赫兹和 30 赫兹的刺激频率，这两个频率分别处于内源性θ范围的高端和远端。光遗传激活 MSA 中的 PV+ 神经元可诱导 MEC 中的人工局域场电位（LFP）振荡，并显著降低内源性θ功率。激活 MSA PV+ 细胞可通过解除抑制引起网格细胞的强激活。因此，LFP 振荡和单细胞相位关系都跟随刺激频率，有效地破坏了网格细胞的相位前驱。这种扰动并不影响网格场的位置。此外，在刺激过程中，网格细胞的信息率明显下降，这表明网格细胞电路下游的空间读出可能受到了影响。最后，尖峰速度相关性在刺激过程中保持稳定，而 LFPθ 的频率和功率都受到了干扰。研究结果表明，θ 振荡与网格细胞空间活动模式之间存在分离。这支持了θ振荡不会导致网格细胞点火模式的理论。

️ 二、研究结果

️2.1 特异性靶向 MSA 中的 PV+细胞

为了靶向从MSA到MEC的GABA能投射，通过向四只PvalbCre大鼠品系的动物注射病毒构建体，选择性地在MSA的PV+细胞中表达通道发光素（ChR2）。ChR2 的免疫组化标记证实，病毒的表达在很大程度上局限于 MSA，用 PV 抗体染色显示，病毒的表达对 PV+ 细胞具有选择性。我们没有观察到任何表达 ChR2 的细胞对 PV 不呈免疫阳性。表达 ChR2 的末端在 MEC 和海马中都很突出，我们在 MEC 的局部观察到 ChR2 表达的突触与 PV+ 细胞体接触。

图 1 PvalbCre 大鼠注射病毒后，MSA 中的 PV+ 细胞选择性地表达沟道发光素（ChR2）。（A）从左侧稍上方看大鼠大脑的插图，紫色突出显示 MSA，蓝色/青色突出显示 MEC，长程投射从 MSA 到 MEC（绿色）。这些投射的目标是 MEC 的所有层，从背侧到腹侧区域。在 MSA 中注射了携带 ChR2 的病毒构建体。(B) 典型动物的三张冠状切片显示了病毒在 MSA 三个不同前后位置的表达范围（绿色）。病毒表达覆盖了 MSA 的大部分区域。(C）病毒在 MSA 中的表达仅限于 PV+ 细胞（红色）。白色箭头标记了病毒（ChR2）和 PV+ 细胞（PV）之间的重叠（上排）。在 MEC、寄生丘（PaS）和海马的所有区域[CA1、CA3 和齿状回（DG）]（下行）都发现了表达病毒的投射。放大图像所选的 MEC 区域以小方块表示。ChR2 标记的隔膜投射以 MEC 中的 PV+ 细胞为目标（小轮廓）。(D) 实验装置图解。在 PvalbCre 大鼠的 MSA 中植入光导纤维，在 MEC 中植入记录电极（两只动物的光导纤维和记录电极也在 MEC 中）。使用蓝色激光（470 nm）以两种不同的频率（11 Hz 和 30 Hz）激活 MSA 中的 PV+ 细胞。

为了确定我们是否能在 MEC 中加速振荡，我们以 11 和 30 Hz 两种不同的频率刺激了 MSA 中的 PV+ 细胞，同时记录了 MEC 中的 LFP 和单细胞活动。所有单细胞记录都位于 MEC 的浅层（LII 和 III）。

️2.2 刺激 MSA 中的 PV+细胞可加速 MEC 中的 LFP 振荡并通过解除抑制驱动网格细胞

我们刺激了 MSA 中的 PV+ 细胞体（图 2A 在图像查看器中打开）或 MEC 中的 PV+ 末梢（图 2D 在图像查看器中打开），同时记录了 PvalbCre 大鼠在探索 1 米乘 1 米开阔地时 MEC 中的 LFP 和单细胞。我们在 MSA 中进行刺激的实验从 10 分钟的基线时段（基线 I）开始，然后是 10 分钟的 11 Hz 刺激、10 分钟的无刺激（基线 II），最后是 10 分钟的 30 Hz 刺激。这四个阶段之间有 10 分钟的休息时间，动物在笼子里休息。刺激开始后，内源性θ（6 到 10 Hz）立即减弱，LFP 振荡转向刺激频率（图 2A 打开图像查看器和图 S3）。因此，MSA中受刺激的PV+细胞的活动控制了MEC的频率振荡。所有基线或刺激时段的平均 PSD 显示出类似的模式，基线时段的峰值为 8 赫兹，而新的峰值则与 11 赫兹或 30 赫兹的刺激频率相对应。以峰值 PSD 的相对高度测量的内源性 Theta 功率在刺激过程中显著降低[汇总会议，平均值 ± SEM；基线 I 对 11 Hz，6.3 ± SEM；基线 I 对 11 Hz，6.3 ± SEM；基线 I 对 11 Hz，6.3 ± SEM]：基线 I，6.3 ± 0.67；11 Hz，0.23 ± 0.052（n = 44，W = 2.0，P = 8.7 × 10-9）；基线 II 与 30 Hz：基线 II，6.3 ± 0.67；11 Hz，0.23 ± 0.052（n = 44，W = 2.0，P = 8.7 × 10-9）：基线 II，6.3 ± 0.74；30 Hz，0.049 ± 0.054（n = 32，W = 0.0，P = 8.0 × 10-7，Wilcoxon 符号秩检验）]。30赫兹刺激时，受刺激频带的相对功率更大[汇集疗程，平均值±SEM；11赫兹与30赫兹比较：11赫兹，18±2.5.5]：11 Hz，18 ± 2.4；30 Hz，85 ± 14（n = 32，W = 30，P = 1.2 × 10-5，Wilcoxon 符号秩检验）]。

图2 MSA中PV+细胞的光遗传起搏取消了MEC中的内源性θ。（A）假定的MSA-MEC连接图解显示，MSA中的PV+细胞（PV）终止于MEC中的中间神经元（IN），这些中间神经元与网格细胞（GC）一起形成一个循环回路。光遗传激活投射 MSA 中 PV+ 细胞的 MEC（蓝色阴影）会导致 MEC 的振荡频率偏移，这一点可从开放场探索期间 LFP 的时频表示中看出。(B) 所有基线和刺激环节的平均 PSD。(C) 相对θ功率和受刺激波段相对功率的累积密度图显示，在两种刺激频率下，内源性θ功率均大幅降低。(D）MEC 光遗传刺激图解。光遗传激活 MEC 中的 MSA PV+ 细胞终端并没有降低内源性 theta 频率。同时记录的两个半球的 LFP 时频表示，其中一个半球受到 11 Hz 的刺激。(E) 与 (B) 类似。当以 11 Hz 频率刺激 MEC 中的 PV+ 细胞终端时，内源性 Theta 仍然存在。(F) 相对θ功率的累积密度图显示，当刺激 MEC 中的 PV+细胞终端时，内源性θ功率减弱。(G）一个网格细胞和一个窄尖峰抑制（NSi）细胞的单细胞尖峰反应光栅图。整个网格细胞和 NSi 细胞群的概率密度显示 NSi 细胞受到快速抑制，随后网格细胞被激活。大约 20 毫秒后，30 赫兹的刺激导致两种细胞类型的第二次激活。(H）MEC 光遗传刺激过程中一个网格细胞和一个 NS 细胞的光栅图。下图叠加了两个单元的概率密度，以说明响应时间的差异。

由于 MSA 中 GABA 能、谷氨酸能和胆碱能神经元之间的相互联系，刺激 PV+ 细胞有可能改变 MSA 中局部谷氨酸能和/或胆碱能神经元的活动。因此，刺激后网格细胞反应的增加可能是 PV+ 细胞刺激导致 MSA 中谷氨酸能或胆碱能神经元延迟激活的结果。为了检验网格细胞的反应是通过 MEC 中的局部中间神经元解除抑制还是来自 MSA 的兴奋性输入增加所致，我们比较了在 MEC 局部刺激 PV+ 细胞终端后网格细胞和 NS 单元的反应。刺激 MEC 中的末梢在网格细胞中产生的反应与刺激 MSA 中的反应延迟相似。这种反应的相似性证明，栅格细胞很可能是在刺激 PV+ 细胞后通过解除抑制而被激活的，而不是通过增加来自 MSA 的谷氨酸能或胆碱能投射的兴奋而激活的。

️2.3 网格细胞跟随刺激频率，取消相位前移

在实验和理论研究中，θ 活动都与网格细胞的空间表征有关。通过在 MSA 中刺激时可靠地控制 MEC 的振荡频率，我们研究了其对网格细胞反应模式的影响。首先，我们观察了尖峰的 PSD，以评估刺激过程中发射率的θ调制。在刺激过程中，这种θ节律性的相对功率明显降低[加权平均值 ± SEM，效应大小 β 和 P 值来自 LMM；基线 I 对 11 Hz：基线 II 对 30 Hz：1.3 ± 0.1（n = 46）；30 Hz：0.5 ± 0.1（n = 35，β = -0.67，§§P = 5.6 × 10-10），这表明尖峰序列在刺激过程中不再受 Theta 的调节。

图 3 网格细胞在 MSA 刺激过程中停止了相位前冲。（A）用宽度为 10 ms 的高斯核进行核估计得到的神经元发射率的功率谱密度估计的 Theta 节律性。(B）θ节律性峰值（6 至 10 赫兹）的累积密度除以 1 赫兹宽的相邻频带的平均功率。(C)与 11 赫兹和 30 赫兹刺激相比，网格细胞基线期的尖峰 LFP 相干性。

在基线阶段，网格细胞与内源性θ频率（约 8 Hz）表现出很强的尖峰一致性，而在刺激过程中，这种一致性有所降低。(D) 累积密度图显示，在 11 赫兹和 30 赫兹的刺激下，网格细胞在内源性 Theta 频率上的尖峰一致性显著降低。两个刺激频段引起的峰值相干性相似。(E) 极坐标图显示了所有网格细胞在基线（内源性θ）和刺激过程（刺激频段）中的θ相位偏好和矢量长度。(F) 在基线 I、11 Hz、基线 II 和 30 Hz 阶段，神经元相位前冲（圆形线性相关 r <0）的 P 值蜂群图（仅显示 P 值低于 0.10 的神经元）。在刺激过程中，我们没有发现明显的相位前冲神经元，黑线以下没有点表示（P < 0.01）。(G) 行显示了两个网格细胞在基线和 11 赫兹刺激过程中的彩色编码速率图。左侧标注了大鼠和单元编号，上方标注了峰值速率和网格度。栅格图表示相对于 LFP（6 到 10 Hz 的带通滤波）的尖峰相位与穿过栅格区域的距离。回归线表示尖峰相位可预测动物在场内的位置。相位前冲的 P 值显示在右侧。两个示例单元在刺激过程中都停止了相位前冲，表现为失去显著的相位前冲（P < 0.01）。

这些发现表明，栅格细胞的相位前冲在刺激过程中受到了干扰。因此，我们确定了所有在基线期（基线 I 和基线 II）相对于内源性 Theta 频段（6 至 10 Hz）有明显相位前移或后退（尖峰在每个 Theta 周期中出现的时间逐渐推迟）的网格细胞。然后，我们使用中描述的方法将其与刺激环节中的相同频段（分别为 11 赫兹和 30 赫兹）进行了比较。为了可靠地识别相位前冲/后冲的丢失，我们使用空间场检测或发射率阈值检测场进入（见方法），分别进行了两项分析。根据这些检测方法，我们按照对集合场交叉和单次运行交叉进行了评估。此外，为了验证分析结果，我们重新分析了 Sargolini 及其合作者的公开数据，并进行了额外的对照，以评估相对于 LFP 中 “随机 ”频带（20 至 25 Hz）的相位前移。有了这些数据，我们就可以使用中列出的 P 值可靠地检测相位前冲的丢失，并重现研究结果 。比较θ波段和随机波段的相位前移显示，在集合场交叉中，我们可以通过阈值 P 值可靠地检测到相位前移的丢失。与此相反，在单次运行试验中，这种检测方法受到假阳性的影响，这可能是由于尖峰计数较低（图 S7）。

对于所有记录单元，在任何一次刺激过程中都没有网格细胞显示显著的相位前冲（场检测，图 3FO 在图像查看器中打开；速率检测，图 S7F），这表明在光遗传起搏过程中相位前冲停止了[显著相位前冲神经元的数量（P < 0.01，R > 0.1）：基线 I，63 个中有 9 个（如图 3 f 所示）；11 Hz，56 个中有 0 个；基线 II，46 个中有 9 个（如图 3 f 所示）；30 Hz，35 个中有 0 个]。

️2.4 网格细胞在 MSA 刺激过程中保持空间稳定，但在抑制过程中显示场外尖峰增加

初次观察时，我们发现网格场的空间发射模式在基线和刺激过程中保持明显的稳定）。然而，在检查速率图时，我们注意到许多网格细胞在刺激过程中显示出发射率的增加或减少。为了检验这种改变是否存在，我们首先比较了每个网格细胞从基线到刺激过程中空间移动的成对相对变化。为了评估变化的幅度，我们使用基线会话的前半部分与后半部分（基线 Ia 与基线 Ib 和基线 IIa 与基线 IIb）创建了对照组。空间移动的比较结果如下（加权平均值 ± SEM、效应大小 β 和 LMM 的 P 值）：基线 Ia 到基线 Ib，0.022 ± 0.0013（n = 63）；基线 I 到 11 Hz，0.022 ± 0.0021（n = 21，β = 0.001，P = 0.87）；基线 I 到基线 II，0.022 ± 0. 002 (n = 21, β = 0.023, P = 0.22)；基线 IIa 到基线 IIb, 0.019 ± 7.0 × 10-5 (n = 46)；基线 II 到 30 Hz, 0.018 ± 0.0026 (n = 16, β = 1.4 × 10-4, P = 0.99)。请注意，相对测量需要相同的神经元出现在随后的环节中，因此减少了本分析中包含的单元数量（n）。

图 4 网格细胞在 MSA 光遗传刺激过程中具有空间稳定性。（A）彩色编码的速率图（上图）和三个网格细胞的运行路径与尖峰叠加（下图），这三个网格细胞记录了所有四个疗程，每个疗程 10 分钟。速率图根据第一个记录时段的热度颜色进行了颜色编码调整。每个速率图上方标注了峰值速率和网格度。速率图左侧标有大鼠编号和单元 ID。(B) 散点图显示多次记录过程中网格细胞空间移动的相对变化。基线 Ia 或 IIa 与基线 Ia 或 IIb（分别为基线 I 或基线 II 的前半部分与后半部分）相比，未发现明显变化。(C）平均速率、最大速率、网格度、空间信息和空间信息特异性的累积密度图。两种速率测量结果均未发现差异；然而，在基线和刺激之间，网格度的变化并不显著，而在比较基线 I 和 11 Hz 时，空间信息速率的变化显著。空间信息特异性没有明显变化。(D) 一个网格单元的光栅图，其中 0 表示 11 赫兹刺激开始。预反应期（Pre：绿色/紫色；-5 至 5 毫秒）和反应期（Resp：橙色/粉色；5 至 11 毫秒）以及脉冲间隔期（Between：蓝色；15 至 -5 毫秒）的尖峰均有标记。大鼠在记录过程中的奔跑轨迹与前反应期、反应期和反应间期的尖峰叠加。黑圈表示已识别网格区域的轮廓。(E) 与 (D) 类似，但显示的是 30 赫兹刺激。小提琴图[最小值到最大值和中位数（黑线）]显示反应期间场外尖峰活动增加。小提琴的宽度与每个值的样本数相对应。*ns, 无显著性意义。

由于刺激会诱发网格细胞的假定抑制，随后是一段抑制期，我们怀疑在激活增加期间会有更多的尖峰落在网格区域之外，从而减少刺激过程中的空间信息，这与 研究结果类似。为了评估这一猜测，我们将每个刺激阶段分为一个前反应阶段，称为 Pre（相对于刺激开始时间为 -5 至 5 ms）；Pre 与 Resp 相比：β = 0.06，P = 2.7 × 10-9；Pre 与 Between 相比：β = 0.024，P = 9.4 × 10-4；Resp 与 Between 相比：β = 0.081，P = 2.7 × 10-17；30 Hz：30赫兹：Pre，0.54 ± 0.019 (n = 35)；Resp，0.54 ± 0.019 (n = 35)；Between，0.49 ± 0.022 (n = 35)；Pre vs. Resp：β = 0.0036，P = 0.84；Pre vs. Between：β = 0.044，§§P = 0.15；Resp vs. Between：β = 0.052，P = 0.028]。这表明场外尖峰是由每次刺激脉冲后尖峰增强的短时间窗引起的。总之，这表明振荡隔输入可以调节稳定场内网格细胞的时间发射，但不是场位置的决定因素。

️2.5 MSA刺激期间网格细胞和NSi细胞的速度相关性完好，而LFP振荡紊乱

一些计算模型预测，为了进行路径整合，网格细胞需要动物的速度信息。研究表明，在单个神经元中至少有两个单独的速度信息源：一个基于发射率，另一个基于振荡频率。如果来自 MSA 的输入受损，振荡频率就会降低；因此，室间隔的输入可能对 MEC 神经元完整的速度表征至关重要。

基于这些假设，我们测试了起搏 MSA PV+ 细胞是否会破坏 MEC 中单个单元基于速率的速度表征。我们计算了单个网格和 NSi 细胞的速度评分，该评分由发射率与动物跑步速度之间的线性关系给出，并在基线和刺激过程中进行比较。我们发现在刺激过程中，网格细胞的速度评分没有明显变化[加权平均值 ± SEM，效应大小 β 和 P 值来自 LMM；基线 I，0.11 ± 0.011（n = 63）；11 Hz，0.094 ± 0. 012（n = 56，β = - 0.013，P = 0.53）；基线 II，0.087 ± 0.0080（n = 46）；30 Hz，0.074 ± 0.0099（n = 35，β = 0.013，§§P = 0.38）；基线 I 和基线 II，β = 0.0094，P = 0.68]。此外，我们还发现，NSi 细胞对速度得分没有明显影响[加权平均值 ± SEM，效应大小 β 和 P 值来自 LMM；基线 I，0.15 ± 0.04（n = 12）；11 Hz，0.18 ± 0.02（n = 25，β = 0.018，P = 0. 69）；基线 II，0.17 ± 0.025（n = 17）；30 Hz，0.21 ± 0.019（n = 32，β = 0.035，P = 0.3）；基线 I 和基线 II，β = 0.017，P = 0.54。

图 5 尽管θ速度调制被破坏，但神经元速度调制是稳定的（A）一个网格细胞和一个 NS 细胞（NSi）在基线和刺激过程中的速度调制示例。每个速度图的上方表示速度得分。纵轴代表归一化发射率。(B) 小提琴图显示基线和刺激过程中网格细胞（上）和 NSi 细胞（下）的速度得分。无论是 11 赫兹还是 30 赫兹的刺激，都不会导致任何一种细胞类型的速度得分发生显著变化。(C) 显示所有记录时段动物奔跑速度配对比较的小提琴图。从基线 I 到 11 Hz，从基线 I 到基线 II，以及从基线 II 到 30 Hz，奔跑速度都略有下降。(D) 在基线 I 和基线 II 中，奔跑速度与 Theta 峰值频率之间的相关性很强，但在 11 赫兹和 30 赫兹刺激期间，两者之间的相关性被破坏。(E）频率得分，由跑步速度与峰值频率之间的相关性表示。从基线Ⅰ到 11 赫兹，从基线Ⅱ到 30 赫兹，频率评分明显降低。(F）在基线 I 和基线 II 中，奔跑速度与 Theta 功率之间的相关性很强，但在 11 赫兹和 30 赫兹刺激时，这种相关性被破坏。(G)功率得分，由奔跑速度与功率之间的相关性表示。从基线 I 到 11 Hz，从基线 II 到 30 Hz，功率得分明显降低。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001, Wilcoxon signed-rank test.

在正常情况下，速度信息既反映在 LFPθ 频率中，也反映在这些振荡的功率中。因此，尽管速度与频率的关系被打破，但速度与功率的关系可能仍在持续，正如之前所观察到的那样。虽然我们在基线训练中观察到跑步速度与θ功率之间存在很强的相关性，但在 11 赫兹和 30 赫兹刺激训练中，这种相关性被完全破坏[平均值 ± SEM，Wilcoxon 符号秩检验；基线 I，0. 15 ± 0.02；11 Hz，-0.02 ± 0.03（W = 110，P = 7.02 × 10-6，n = 44）；基线 II，0.11 ± 0.02；30 Hz，0.05 ± 0.02（W = 152，P = 0.0362，n = 32）。这些结果表明，θ 的速度调制与单个 MEC 神经元的速度调制无关，稳定的网格细胞点火模式并不需要θ 的速度调制。

️ 三、讨论

在这项研究中，我们研究了实验结果和网格细胞混合模型所假设的θ振荡与网格细胞空间表征之间的因果关系。我们的研究表明，网格细胞的空间和时间发射模式是可以分离的。实验诱导的振荡破坏了 MEC 的内源性 Theta 活动，损害了 LFP 的相位前冲和速度调制，但网格细胞的空间表征和速度调制仍然完好无损。

虽然网格细胞受到外加振荡频率的强烈调制，但这并没有破坏它们的空间发射模式。然而，我们确实看到了空间信息率的降低，这种降低仅限于在 MSA 中光电刺激 PV+ 细胞激活网格细胞的短时间内。网格细胞可能是通过解除抑制而被激活的，从而为抑制性回路提供了更多支持，在抑制性回路中，MSA 中的 PV+ 细胞为 MEC 表层的局部中间神经元提供单突触输入，而这些中间神经元又与网格细胞紧密相连。这种抑制性回路似乎对 MEC 的θ 振荡起着决定性作用。越来越多的证据表明，MSA中的GABA能/PV+神经元负责MEC和海马的θ振荡起搏。栅格细胞对刺激频率表现出很大的相位锁定，导致栅格细胞相位前冲受损。这表明网格细胞并不依赖相位前冲来维持稳定的空间表征。

在本研究中，我们旨在完全破坏内源性θ，以评估其对网格细胞点火特性的作用。为此，我们通过光遗传学刺激 PV+ 细胞诱导了强同步活动，通过推测性抑制完全取消了网格细胞的相位前冲和θ相位锁定，并破坏了 LFP θ的时间调制。由于刺激脉冲的高振幅和规律性，所产生的振荡无法与内源性θ振荡相提并论。鉴于我们的目的是评估栅格细胞的稳健性，我们利用了这种非生理振荡范例，它使我们能够证明θ振荡的相位前移或速度调制对于栅格细胞保持其空间特性都不是至关重要的。然而，栅格细胞中相位前冲的消失可能不是 MSA 驱动的直接结果，而是强刺激引起的同步造成的，这将抵消强迫尖峰期间的任何时间信息。此外，强刺激机制可能会改变电路动力学，从而可能使本研究对神经元振荡机理基础的解释出现偏差。为了更好地评估 MSA 如何调节相位前冲和相位锁定，非方形脉冲、刺激间期的时间抖动和不同刺激幅度的刺激机制可能是更好的选择。这可能有助于创造一种人工的室间隔非振荡输入或室间隔非稳定频率输入，就像在蝙蝠身上观察到的那样。因此，需要进行更多涉及生理刺激的进一步研究，以进一步确定 MSA 和 MEC 中振荡现象的特征。

之前的实验表明，药理失活 MSA 会破坏网格细胞的空间发射模式以及 MEC 和海马中的 Theta 振荡。这被认为是θ振荡对网格细胞活动至关重要的证据。然而，MSA 的药理失活也会沉默海马和海马旁区域的输入，海马的失活已被证明会破坏网格细胞的发射。MSA 失活也会扰乱海马旁的活动，而海马旁的活动反过来也会损害网格细胞的活动。因此，MSA 失活后受损的网格细胞模式是由直接输入到 MEC 引起的，还是由海马活动的干扰间接引起的，这一点尚未解决。由于药理操作的时间和空间分辨率较低，在以前的实验中将干预与网格细胞活动的功能特性直接联系起来具有挑战性。药理学操作也缺乏必要的细胞类型特异性，无法评估隔脑-脑室投射的不同部分的作用。因此，本研究在 PvalbCre 大鼠系中使用的细胞特异性光遗传激活可能克服了这两个局限性。

θ节律的频率和振幅随着跑步速度的增加而增加，这一点已经得到证实，表明θ振荡在速度表征中起着一定的作用。动物的被动运输不会降低整体的θ节律，但会消除θ的线性速度调制，这意味着θ频率不会随着跑步速度的增加而增加。在基线记录中，奔跑速度与θ频率之间的强正相关性在适度的奔跑速度下达到饱和，当我们用光遗传刺激起搏 MSA 中的 PV+ 神经元时，这种正相关性被破坏。在同样的刺激下，MEC 中神经元的发射率仍受速度的调节，这与最近的一项发现非常吻合，即来自 MSA 的输入并不通过内侧速度细胞的发射率来控制速度编码。这表明，网格细胞空间发射模式的产生与θ-速度关系无关。此外，对网格细胞的被动运动影响更可能是由于缺乏自我运动速度信号。

通常情况下，CAN 模型与速度输入产生的路径整合有关，速度输入的方向和速度都会提供给网络。虽然这些模型可以维持振荡输入，但它们通常无法解释网格细胞中的时间活动，例如相位前移，纳夫拉蒂洛娃及其同事的研究除外。然而，CAN 模型和最近的规范模型是否能在与本文类似的干预过程中保持稳定的空间模式还有待确定。

有证据表明，网格细胞依赖于路径整合，其中锚定环境线索被视为一种纠错策略。此外，一些证据表明，在没有路径信息的情况下，网格细胞利用环境线索来稳定网格图。因此，在所呈现的数据中观察到的网格图的保留可能是在刺激过程中利用记录环境中的线索进行校正的结果。根据 OI 理论和混合理论，实验观察到的模式是通过路径整合产生的。因此，我们认为我们提出的结论仍然成立，即提出的结果与既定的 OI 理论相矛盾。具体来说，路径积分不可能由相位前驱驱动，实验观察到的网格模式的出现必须依赖于其他速度信号，或者根本不依赖于路径积分。然而，当动物探索新环境时，θ 振荡如何影响网格模式的出现仍有待探索。

最近的理论研究将 MSA 起搏θ与星状细胞中的共振和反弹尖峰之间的时间关系联系起来，为空间表征、相位前移和θ周期跳跃提供了基础。这些模型共同表明，θ振荡与网格细胞的空间表征密切相关。这与本文所报告的实验结果相矛盾，因此，观察这些模型是否能适应时间和空间网格细胞特性之间的分离将是非常有趣的。

️ 四、研究方法

️4.1 研究对象

我们使用雄性 Long-Evans PvalbCre 基因敲入大鼠（3 至 8 个月大，手术时体重 350 至 550 克）（32）。利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术将一个内部核糖体进入位点-Cre 重组酶序列盒插入 Pvalb 基因座。对该菌株的全基因组测序表明，供体正确插入了所需基因座，但也发现供体盒随机插入了 1 号染色体的基因间区（chr1：265、469、284-265、469 和 502）。由于该区域缺乏转录调节因子，这种随机插入不太可能导致 Cre 的非特异性表达。免疫组化验证也证明了这一点，免疫组化显示 Pvalb 与 Cre 高度共表达（32）。手术后，动物被单独饲养在 GR1800光照/12 小时黑暗的时间表，测试在光照阶段进行。大鼠在训练前 18 至 24 小时被剥夺食物，体重保持在自由采食体重的 85% 至 90%，并可自由饮水。实验按照《挪威动物福利法》和《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》进行。

️4.2 手术过程

手术在无菌环境中进行；用异氟烷混合空气（5%诱导，1.5%至 2%维持）麻醉大鼠，并将其固定在立体定向架上。手术开始前，给它们皮下注射丁丙诺啡（0.04 毫克/千克），并在头皮局部皮下注射布比卡因/肾上腺素（马卡因肾上腺素，13.2 毫克/千克），用乙醇和洗必泰清洗和剃毛。在整个手术过程中，使用带有反馈机制的加热垫的 MouseSTAT 系统对心率和核心体温进行连续监测，并利用后爪抽出反射评估麻醉深度。手术结束后，给动物皮下注射卡洛芬（5 毫克/千克），清洗伤口边缘，然后涂抹利多卡因局部麻醉软膏。术后 3 天内重复上述操作。

️4.3 注射携带蛋白克隆的病毒和植入电极

使用手持式 Perfecta 300 牙科钻头在澳门巴黎人娱乐官网上方和双侧澳门巴黎人娱乐官网上方进行开颅手术。四极管植入和注射在一次手术中完成。使用汉密尔顿注射器将病毒载体 AAV5-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (UNC) 注入 MSA。注射在两个位置，每个位置有两个深度（从颅骨表面测量，分别为 6.5 和 7.5 ± 0.2 毫米）。注射位置分别位于前囟前 0.6 毫米和 1.0 毫米处以及中线，每个位置的注射总量为 300 毫升。注射以 50 毫升/分钟的速度逐步进行，针头在注射部位停留 5 分钟后再拔出。在横窦前方 0.4 ± 0.1 毫米、距中线 4.5 ± 0.1 毫米处的 MEC 上方植入四极/电极。电极由 16 通道微型驱动器固定，并通过固定在颅骨上的宝石螺钉进行地面参照。包含光纤、四极杆或两者的植入物用珠宝商螺丝和牙科水泥固定在头骨上。为避免激光的光线透过植入物，植入物用黑色指甲油密封。

️4.4 细胞外记录和处理

Axona 微型驱动器通过定制适配器连接到 Intan RHD2132 头台。头架通过细长的串行外设接口（SPI）电缆连接到 Open Ephys 采集板。使用 Open Ephys 图形用户界面采集记录，保存数据并实时显示 LFP、高通滤波信号和尖峰信号。此外，我们还使用安装在天花板上的 Point Grey Flea3 摄像机来跟踪动物的位置。使用跟踪插件在 Open Ephys 中对跟踪进行监控，该插件使用 Bonsai 进行图像分析，使用 Open Ephys 进行同步、存储和轨迹可视化。光遗传刺激是使用 473 纳米蓝色二极管泵浦固体激光器进行的，功率在 20 至 50 毫瓦之间。激光由 Pulse Pal 2 刺激器触发，该刺激器由 Open Ephys 图形用户界面控制。我们使用从 Pulse Pal 刺激器到激光控制器的脉冲串。这组脉冲由 5 毫秒的脉冲和 85 毫秒（用于 11 赫兹刺激）或 28 毫秒（用于 30 赫兹刺激）的脉冲间隔组成。

️东莞富临医疗科技有限公司是 Intan 亚洲代理商，为亚洲客户供应 Intan 电生理产品与配套产品

️4.5 记录程序

动物在手术前一周开始的每日训练中适应记录环境。记录环境由一个 1 米乘 1 米的黑盒子组成，其中一面墙上贴有一张白色 A4 纸，作为局部提示。为了激励动物积极探索环境，在整个记录过程中都会随机向场内投掷巧克力碎屑（Weetos）。电生理记录在手术后 3 周开始，以确保病毒的正常表达。在寻找网格细胞的记录过程中，动物在竞技场中奔跑10到20分钟（取决于它们覆盖整个环境的速度）。在两次记录之间，如果没有记录到网格细胞，则以 50 μm 为单位向下调整四极，然后让动物在笼子里休息 20 到 30 分钟。

当可以检测到网格细胞时，我们就开始进行光遗传学实验，实验由四个记录环节组成。首先是没有激光刺激的基线时段（基线I），然后是11赫兹的刺激时段，激光刺激持续10分钟。光遗传刺激在记录过程开始后 1 分钟开始。下一个记录环节是另一个基线环节（基线 II），然后是最后一个 30 赫兹的刺激环节。所有环节持续 10 到 20 分钟，中间休息 10 到 20 分钟，让动物在笼子里休息。为了确保在基线和刺激环节中记录到相同的细胞，电极在这些环节之间没有移动。然而，在进行了一组光遗传学实验后，我们再次降低电极，在更腹侧的位置寻找新的网格细胞。其中两只动物除了 MSA 外，在 MEC 也有视纤维。如上所述，我们对MEC进行了光遗传刺激，但每次只刺激一个半球，而且只使用11赫兹的激光脉冲。

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