多肽合成中氨基酸活化酯的制备研究

摘要：氨基酸活化反应对合成多肽的产率及纯度具有重要影响。以芴甲氧羰基-缬氨酸为研究对象, 首次采用反相高效液相色谱法检测活化反应过程, 建立了芴甲氧羰基-缬氨酸活化酯的分析方法, 优化了氨基酸活化酯的制备条件, 并引入了新的用于Fmoc策略合成多肽的溶剂体系——四氢呋喃。结果表明:溶剂和活化试剂对活化酯的产率影响显著;活化酯制备的最佳反应条件为n (Fmoc-Val-OH) ∶n (HOBt) ∶n (DCC) =1∶1∶1.2, 溶剂为THF, 反应温度为25℃。

️关键词： 活化酯 反相高效液相色谱 多肽合成 氨基酸

自从Merrifield [1] 发明固相多肽合成技术以来, 多肽合成技术就迅速发展起来。目前对于合成过程的研究大都集中在去保护工艺、耦合工艺、切割工艺等步骤, 而对于氨基酸活化工艺的研究国内外报道却很少 [2, 3] 。由于活化反应直接影响到氨基酸与氨基酸之间的缩合成肽反应的效率, 所以对氨基酸活化反应进行研究, 同样是多肽合成的一个重要环节。以DMF或NMP等极性溶剂为反应介质, 采用二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑 (DCC/HOBt) 为缩合试剂, 活化氨基酸的羧基形成苯并三唑 (OBt) 活化酯的方法, 具有价格低廉, 反应温和、副反应少的优点, 应用最为广泛 [4] 。但是此法反应相对较慢, 这主要和由活化反应产生的活化酯分子的数量有关。已有报导的活化酯分析方法主要是针对烷基化磺酸酯类如苯磺酰氯、甲基磺酰氯等, 采用的分离体系包括正相、反相、非水反相等 [5-8] , 未见有针对氨基酸OBt活化酯的分析及制备研究的报道。本文以芴甲氧羰基-缬氨酸 (Fmoc-Val-OH) 为对象, 首次以反相高效液相色谱 (RPLC) 检测反应过程, 分别研究了反应物比例、溶剂、反应时间和反应温度对活化酯产率的影响, 引入了新的用于Fmoc策略合成多肽的溶剂体系——四氢呋喃, 得出了制备氨基酸活化酯的最佳条件, 这对直观地了解活化反应的进程, 建立Fmoc保护氨基酸的活化反应动力学方程, 缩短缩合反应时间等过程具有指导意义。

️1.1 Fmoc-Val-OH活化酯 (Fmoc-Val-OBt) 的制备

Fmoc-Val-OH、DCC以及HOBt按一定比例溶于溶剂中反应。Fmoc-Val-OH投料浓度为0.1 mol/L。分别改变溶剂、反应温度、活化试剂 (DCC, HOBt) 比例及反应时间, 研究这些因素对活化酯产率 (由于无标准品, 以活化酯的面积百分比来表示其产率) 的影响。

️1.2 Fmoc-Val-OH活化酯的分析鉴定

Fmoc-Val-OBt分析:取活化液, 色谱甲醇稀释至适当浓度, 再经过0.22 μm有机滤膜过滤, RPLC分析活化酯。色谱条件如下:色谱柱:Cromasil C18分析柱 (5 μm, 4.6×250 mm) ;流动相A为甲醇, B为0.1%甲酸水溶液;流速1 mL/min;洗脱梯度为:0～5 min, 60%B～20%B, 然后维持15 min;紫外监测器, 检测波长:267 nm;进样量:20 μL;室温。

Fmoc-Val-OBt鉴定:MS (70 eV) , m/z:457.2 (M+) 。

️2.1 溶剂对Fmoc-Val-OBt产率的影响

n (Fmoc-Val-OH) ∶n (HOBt) ∶n (DCC) =1∶1∶1, 均为0.1 mmol, 25 ℃, 不同溶剂体系对Fmoc-Val-OBt产率的影响见图1。

图1 溶剂对Fmoc-Val-OBt产率的影响Fig.1 Effect of solvents on yield of Fmoc-Val-Obt

1.THF;2.DCM/DMF=1∶3;3.DMF;4.NMP;5.Py/DMF=1∶3

由图1可见, 活化酯的产率随反应时间的延长而增加, 达到最大值后, 继续反应, 产率会有小量下降, 这与活化酯的部分分解有关;反应溶剂对活化酯产率的影响较大, 采用弱极性溶剂THF, 或在极性溶剂DMF中加入弱极性溶剂DCM (V (DCM) ∶V (DMF) =1∶3) , 可以大大提高活化酯的产率, 最高产率分别为44.11%和27.29%, 而单纯以强极性溶剂DMF、NMP为反应介质, 活化酯产率均不高, 最高仅为25.71%, 这也是采用活化酯方法反应时间过长的主要原因;弱碱强极性溶剂 (V (Py) ∶V (DMF) =1∶3) 中, 活化酯的产率也不高, 最高为16.31%;THF是最好的活化酯反应溶剂, 在150 min左右活化酯产物产率最高, 达44.11%。

️2.2 温度对Fmoc-Val-OBt产率的影响

表1 温度对活化酯产率的影响Tab.1 Effect of temperature on yield of active ester

n (Fmoc-Val-OH) ∶n (HOBt) ∶n (DCC) =1∶1∶1, 均为0.1 mmol, 溶剂为THF, 温度选择25和 0 ℃, Fmoc-Val-OBt的产率见表1。

多肽合成一般在室温或低温下进行, 较高的温度容易引发氨基酸消旋等副反应的发生, 本文选择25和0 ℃为反应温度。结果表明, 低温下氨基酸的活化速率明显较慢, 产率也较低, 210 min仅为28.37%, 而活化反应在室温下进行, 反应加快, 150 min的产率最高, 为44.11%。

️2.3 反应物比例对Fmoc-Val-OBt产率的影响

Fmoc-Val-OH为0.1 mol/L, 用量为0.1 mmol, 溶剂为THF, 温度25 ℃, 改变DCC和HOBt与Fmoc-Val-OH的物质的量比, Fmoc-Val-Obt的产率见图2。

图2 活化剂对Fmoc-Val-OBt产率的影响Fig.2 Effect of active reagents on yield of Fmoc-Val-Obt

1.1.4 DCC;2.1.2 DCC;3.1 HOBT/DCC;4.1.2 HOBT;5.0.8 HOBTZ

由图2可知, DCC用量为0.1 mmol, HOBt的量分别为Fmoc-Val-OH的0.8、1及1.2倍, 活化酯的产率以n (HOBt) ∶n (Fmoc-Val-OH) =1∶1最高, 为44.11%;HOBt用量为0.1 mmol, DCC的量分别为Fmoc-Val-OH的1.2和1.4倍, 活化酯的产率以n (DCC) ∶n (Fmoc-Val-OH) =1.2∶1最高, 为48.41%。综上所述, 反应物DCC作为主要的活化试剂, 增大其比例有助于活化酯产率的提高, 而增加或减少HOBt的用量, 活化酯产率均会下降。最终确定反应物的最佳比例为n (Fmoc-Val-OH) ∶n (HOBt) ∶n (DCC) =1∶1∶1.2。

首次以Re-HPLC为分析手段, 以甲醇/水为流动相, 建立了Fmoc-Val-OBt活化酯的分析方法, 并优化了它的制备工艺, 引入了新的用于Fmoc策略合成多肽的溶剂体系——THF。结果表明:溶剂、活化试剂DCC及HOBt的用量对活化酯的产率影响较大, 采用弱极性溶剂THF、DCC过量0.2倍能大大提高活化酯的产率。

最佳制备条件为:n (Fmoc-Val-OH) ∶n (HOBt) ∶n (DCC) =1∶1∶1.2, 溶剂为THF, 温度 25 ℃, 活化酯产率达48.41%。

通过Fmoc-Val-OH活化反应的研究, 为其他Fmoc氨基酸的活化反应的研究及改进多肽合成工艺提供了导。

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