基于宏基因组的肠道微生物组、宿主和饮食暴露组的人类宏蛋白质组学揭示了健康和炎症性肠病的标志物

️Metagenome-informed metaproteomics of the human gut microbiome, host, and dietary exposome uncovers signatures of health and inflammatory bowel disease

️基于宏基因组的肠道微生物组、宿主和饮食暴露组的人类宏蛋白质组学揭示了健康和炎症性肠病的标志物

作者：Rafael Valdés-Mas等

期刊：Cell

发表时间：2025.01.20

组学策略：宏基因组、宏蛋白组

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.12.016

宿主-微生物组-饮食的相互作用在调节人类健康中至关重要，但对其直接功能评估仍具挑战性。本研究采用宏基因组信息引申的宏蛋白质组学（MIM），在小鼠和人类中以非侵入性方式探索共生菌和病原体定植、营养改变及抗生素扰动下的物种水平微生物组-宿主相互作用。MIM在多种临床和饮食背景下准确表征了营养暴露特征，并在人类炎症性肠病（IBD）中揭示了由宿主炎症信号驱动的“组成性菌群失调”和“功能性菌群失调”。微生物组移植揭示了这些宿主-共生菌交叉响应模式的早期动力学，同时通过预测分析发现了优于钙卫蛋白（S100A8/S100A9）的候选IBD生物标志物。MIM还能评估IBD相关的饮食模式、治疗依从性及小肠吸收异常。通过并行分析饮食-细菌-宿主，MIM揭示了塑造肠道生态的跨界相互作用，并为个性化诊疗提供了新视角。

图1. 实验流程概要

肠道微生物组、宿主和饮食的复杂相互作用是维持健康或引发疾病的关键。然而，传统研究方法（如宏基因组测序）主要关注微生物的基因组成，无法直接反映其功能活性。蛋白质作为生命活动的直接执行者，其表达水平更能体现微生物和宿主的动态功能状态。炎症性肠病（IBD）等肠道疾病与微生物组失调密切相关，但现有诊断标志物（如钙卫蛋白）敏感性和特异性有限，且缺乏对饮食暴露的客观评估方法。

本研究提出宏基因组信息引申的宏蛋白质组学（MIM），通过整合宏基因组数据与高分辨率质谱技术，首次实现了对宿主、微生物组和饮食蛋白质组的同步分析，揭示了IBD中未被发现的功能失调机制。

️（1）方法原理

数据库构建：基于每个实验的宏基因组数据，构建包含宿主、微生物和饮食蛋白质的参考目录。通过三步过滤（丰度>95%、基因组覆盖>70%、蛋白覆盖>75%），确保数据库的精准性。

质谱分析：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，结合物种特异性肽段识别，实现蛋白质的定量和分类学解析。

跨界整合：同时分析宿主免疫蛋白、微生物功能蛋白及饮食残留蛋白，揭示三者间的动态交互。

️（2）验证与优势

体外验证：在单菌培养和复杂菌群模型中，MIM的物种分辨率优于传统宏蛋白质组学方法。

计算机模拟：合成微生物群落的蛋白质识别准确率>97%，且能排除无关物种的干扰。

体内验证：在无菌小鼠定植、病原感染和饮食干预模型中，MIM成功捕获了宿主抗菌肽响应和微生物功能变化。

️1.MIM对微生物组-宿主的同时评估

图2. 微生物组的宏基因组信息宏蛋白质组学（MIM）

为了应对肠道蛋白质分析的挑战，研究采用了基于宏基因组的宏蛋白质组学（MIM）方法，该方法能生成全面的蛋白质参考目录，从而量化饮食、宿主及其微生物组中的大多数肠道蛋白质。研究中采用颜色编码区分不同来源的蛋白质，并通过逐步筛选过程避免误识别细菌蛋白质，确保了高分类分辨率。在小鼠和人类样本中，MIM平均每份样本分别检测到数百种宿主、细菌及饮食蛋白质。此外，通过体外、体外模拟和体内实验对MIM进行了基准测试，证明其具有更高的灵敏度、特异性和增强的分类分辨率。尤其是在复杂共生定殖、病原体感染和饮食干扰设置中，MIM能够准确表征宿主免疫反应及微生物功能变化。总之，MIM提供了一种准确进行物种分辨的功能性微生物组特征分析的方法，同时也能全面评估宿主肠道反应组，且在许多情况下优于其他基因组和蛋白质组学方法。

️2.MIM对人类GIT沿程的功能性微生物组-宿主相互作用评估

图3. 健康和受抗生素干扰的人类的宿主微生物群MIM景观

与鸟枪法宏基因组分析相比，基于MIM的分析在健康受试者的粪便样本中产生了不同的信号，揭示了由于基因表达模式导致的细菌蛋白质丰度和基因丰度之间的显著差异，表明许多细菌蛋白质无法仅通过基因组数据推断，尤其是细胞外蛋白。MIM能够以高分辨率将绝大多数微生物蛋白质分配到物种水平，并且在复杂微生物组成中显示出更高的分类分辨率。此外，MIM检测显示人类胃肠道（GIT）沿程的生态位特异性变化，在治疗初治个体中细菌蛋白质数量和物种多样性从胃向远端GIT增加，而广谱抗生素治疗则改变了这种模式，表现为兼性厌氧菌的扩张和特定细菌蛋白的比例增加。MIM还揭示了宿主蛋白沿GIT分布的独特聚类，并观察到抗生素治疗对某些宿主蛋白有显著影响，但未改变整体宿主蛋白配置，这为理解抗生素治疗对GIT的影响提供了新视角。

️3.饮食暴露组的蛋白质定量

图4. MIM可准确识别小鼠和人类的饮食暴露情况

通过MIM分析，研究不仅能够准确识别饮食来源的蛋白质，为每项分析提供饮食暴露组的定量评估，还展示了其在不同实验设置下的应用潜力。首先，基于标准化饮食问卷编制了包含310种可食用植物和动物物种的数据库，并确保仅使用每个饮食属的独特蛋白标记物作为参考进行搜索和定量。在小鼠实验中，MIM成功识别了多种饲料中的所有饮食成分，并能区分特定饮食对胃肠道消化功能的影响。进一步的人体试验显示，MIM能通过粪便样本准确反映短期饮食变化，检测到特定食物消费的证据，并以剂量依赖的方式敏感地检测花生等食物的摄入量。全球范围内的队列分析表明，MIM能够捕捉到由地理和文化差异驱动的营养组成的重大变异性，例如在以色列和德国人群中观察到的不同水平的猪肉和鸡肉蛋白暴露，这些发现未被基于测序的方法如MEDI管道所捕捉到。总体而言，MIM提供了一种强大的工具，用于量化饮食暴露、理解消化功能变化及评估跨人群的营养差异。

️4.功能解析宿主-共生菌-饮食交互调节在小鼠肠道自身炎症中的作用

图5. 小鼠肠道炎症过程中宿主微生物组饮食MIM的变化

通过MIM分析，研究揭示了在诱导小鼠急性硫酸葡聚糖（DSS）结肠炎模型过程中肠道微生物群和宿主蛋白的复杂相互作用及变化。MIM不仅识别出“组成性菌群失调”和“功能性菌群失调”两种不同的菌群失衡模式，还量化了疾病进程中宿主分泌蛋白的炎症反应和抗菌肽响应。此外，MIM能够预测共生菌的丢失和结肠炎相关物种的富集，并生成了与疾病严重程度相关的宿主和菌群生物标志物。研究还发现，在肠道炎症期间，粪便中饮食来源的蛋白质相对丰度增加，推测这可能是由于小肠消化、吸收功能障碍所致，并且这种变化与特定营养素的独特动力学模式相关。相比之下，基于宏基因组的方法未能捕捉这些细微的变化，表明MIM提供了一种更为精确的手段来评估肠道炎症过程中的微生物、宿主蛋白以及饮食成分的变化。通过移植实验进一步证实了宿主-微生物群相互作用在炎症条件下的动态变化及其对无菌宿主的影响，为理解IBD等疾病的病理机制提供了新的视角。

️5.MIM揭示人类IBD中宿主-微生物组功能程序的改变

图6. 人IBD中宿主微生物群饮食肠道MIM谱

通过MIM分析，研究揭示了在人类IBD（包括儿科克罗恩病和成人溃疡性结肠炎）中宿主与微生物组之间的复杂相互作用及显著差异。ISR-pCD患者和健康对照组之间不仅在细菌MIM谱上存在显著差异，还发现了与临床参数相关的特定细菌蛋白变化，并且宿主的免疫功能相关蛋白也显示出不同模式。同样，在GER-UC成人队列中观察到了类似的微生物MIM转变和与健康对照组的显著差异，特别是在免疫和抗菌反应方面。MIM在区分疾病状态和健康对照方面表现优于基于基因丰度的宏基因组学方法，并能识别出更多的差异丰度蛋白质和细菌途径。研究还确定了几种菌群失调模式，包括组成性和功能性菌群失调，后者表现为某些细菌种类中离散蛋白质表达的变化而非整体分类丰度的改变。此外，通过将健康对照组或GER-UC患者的粪便微生物群移植到无菌小鼠中，发现接受UC微生物群的小鼠表现出特定的组成性和功能性菌群失调，但未引发明显的自身炎症反应，表明UC相关微生物群在没有宿主IBD易感因素的情况下不太可能单独导致急性炎症。这些发现为理解IBD的病理机制提供了新的视角，并强调了MIM作为一种强有力的工具，用于深入探索宿主-微生物组相互作用及其在疾病中的角色。

️6.粪便饮食蛋白质组学评估揭示人类IBD中与炎症相关的蛋白质吸收不良

图7. MIM识别了IBD中的生态失调亚型

研究通过非侵入性的粪便营养MIM评估，探索了其在人类IBD中的潜在作用，特别是在新诊断的ISR-pCD患者接受一线抗炎排他性肠内营养（EEN）治疗后的情况。结果显示，随着EEN的实施，粪便饮食蛋白信号如预期减少，但个体间差异显著，且粪便中检测到的饮食蛋白数量与炎症标志物水平之间存在正相关，提示EEN的依从性和/或肠道炎症减轻可能直接影响这些变化。此外，通过对两个HMP IBD队列的分析发现，在伴有上消化道受累的IBD患者中，粪便饮食蛋白总量显著高于健康对照组和仅显示回结肠受累的患者，表明上消化道小肠吸收不良可能是导致粪便饮食蛋白积聚的原因。这些发现展示了利用MIM非侵入性地量化人类小肠功能特征的潜力，并为未来临床验证提供了前景，尤其是在模拟功能性小肠模式方面。

️7.MIM使识别优于钙卫蛋白的候选IBD生物标志物成为可能

图8. 基于MIM的非侵入性炎症性肠病生物标志物

研究利用MIM技术筛选出可用于诊断IBD（包括UC和CD）的粪便细菌和宿主蛋白组合，这些组合不仅增强了现有的钙卫蛋白生物标志物，还在某些情况下表现出更高的诊断准确性。通过分析多个队列的数据，研究识别出在不同队列中具有高诊断精度的蛋白质组合，并发现了一些特定的蛋白质对，如乳铁蛋白与ppdK酶、血红素结合蛋白与甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在区分成人CD和UC方面表现尤为突出。此外，研究还探索了MIM在预测疾病严重程度方面的潜力，发现多个蛋白质对能有效预测IBD的严重程度，且准确性高于钙卫蛋白。特别地，微生物组功能可能比其组成更能代表健康与疾病状态之间的差异。最后，研究通过ELISA验证了两个候选生物标志物（髓过氧化物酶和髓细胞碱性蛋白）的有效性，表明未来结合生成与优化基于ELISA的粪便检测方法，将进一步验证并可能提升MIM在IBD诊断中的应用价值。

本研究通过引入MIM方法，实现了对活性物种水平的细菌群落结构和功能的直接评估，揭示了在IBD中特定共生菌种内蛋白质模块的离散变化模式，并识别出可能驱动疾病的“驱动”型共生菌。MIM不仅表征了宿主对微生物群变化的反应，如发现新的抗菌肽和炎症相关蛋白质候选物，还展示了优于传统钙卫蛋白的诊断能力，尤其是在区分CD和UC方面。此外，MIM能够量化饮食暴露及其对宿主-微生物群相互作用的影响，克服了传统饮食评估方法的局限性，并能非侵入性地追踪吸收不良和其他小肠功能特征。这些进展共同构成了IPHOMED（宿主-微生物群-饮食综合蛋白基因组学）框架，有助于深入理解与微生物群相关的疾病发病机制，同时开辟了新的诊断和治疗途径。