Open Ephys 采集板嗅觉皮层腹侧顶带神经元对目标导向行为不同任务元素的调节

腹侧顶带 (vTT) 是嗅觉皮层的一个组成部分，它接收自下而上的气味信号和自上而下的信号。然而，vTT 在气味编码和输入整合中的作用尚不清楚。在这里，我们通过记录小鼠在执行学习气味引导的奖励导向任务期间单个 vTT 神经元的活动来研究 vTT 在这些过程中的参与情况。我们报告说，单个 vTT 细胞高度适应学习任务的特定行为时期，其中增加的放电持续时间与行为时期的时间长度相关。记录的 vTT 细胞中增加放电的峰值时间几乎涵盖了任务的整个时间窗口。总的来说，我们的结果表明，vTT 细胞在特定的行为背景下被选择性激活，并且 vTT 的功能在目标导向行为期间以依赖于环境的方式动态变化。

️ 一、介绍

在哺乳动物中，嗅觉上皮中的感觉神经元检测到的气味信号通过嗅球传递到嗅觉皮层。嗅球中的僧帽细胞和丛状细胞将轴突投射到嗅觉皮层的各个区域。尽管人们对嗅觉感觉神经元如何编码气味分子以及嗅球和嗅觉皮层中的神经回路如何处理气味信号的了解越来越多，但我们对嗅觉皮层不同区域如何将嗅觉感觉信息转化为行为输出的理解仍然有限。在目前的研究中，我们研究了腹侧顶带 (vTT)（位于嗅脚腹内侧的嗅觉皮层中一个相对未开发的区）如何将气味信号的感知转化为奖励导向行为。

视觉、听觉和躯体感觉皮层的生理研究表明，新皮层感觉区神经元接收来自环境的感觉信号，以及由高阶认知和行为决策过程内部产生的自上而下的信号，包括注意力、奖励预测、工作记忆和行为选择过程。在嗅觉回路中，嗅觉结节神经元编码目标导向行为，当动物选择性地注意特定气味时表现出增强的嗅觉反应。此外，在小鼠不同的动机行为过程中，嗅觉结节中不同细胞的 c-Fos 表达（神经元活动标志物）会增加。然而，vTT 的生理和行为功能尚不清楚。为了研究 vTT 神经元是否受认知和行为决策过程的调节，我们在小鼠进行一系列由气味引导、目标导向的行为时记录了单个 vTT 细胞的脉冲活动。

我们观察到，在气味引导的目标导向行为过程中，单个 vTT 神经元的放电与目标导向任务流相关的不同任务元素高度相关，每个任务元素都发生在特定的行为环境中。我们的结果表明，vTT 功能是动态的，而不是固定的，因此在一系列进食和饮水行为中，信息处理模式的变化以依赖于环境的方式发生。

️ 二、结果

️2.1 气味引导的 go/no-go 任务中气味呈现阶段 vTT 细胞的活动

为了研究 vTT 细胞放电如何随着气味引导的目标导向行为而变化，我们记录了在气味引导的 go/no-go 任务中 vTT 细胞的神经活动，并提供水奖励（图 1A）。在此任务中，在右侧气味端口呈现的光刺激向限水小鼠发出信号，让其开始任务并将鼻子伸入气味端口。在戳鼻子的同时，在气味端口中呈现气味提示 500 毫秒。小鼠需要在气味呈现期间将鼻子放在气味端口中以嗅闻气味提示。气味呈现后，灯关闭，小鼠可以将鼻子从气味端口缩回。如果呈现了 go 气味提示（丁香酚），则要求小鼠在 2 秒的超时时间内移动到左侧水端口并将头伸入其中以获得水奖励（go 试验）。在水口，小鼠需要将头放在水口中 300 毫秒以等待水的送达。在头部戳刺后 300 毫秒送达一滴水（6 μL）。如果呈现了不通过的气味提示（乙酸戊酯），则要求小鼠在气味送达结束后 2 秒内停留在气味口附近，而不将头伸入水口（不通过试验）。经过良好的训练后，小鼠的行为准确率在整个试验期间保持在 80% 以上。在通过试验中，气味刺激开始后鼻子戳刺的中位持续时间为 839 毫秒（四分位距：703-1003 毫秒），在不通过试验中为 738 毫秒（四分位距：621-946 毫秒）（来自六只小鼠的 57 个试验）。

图 1.气味引导的 go/no-go 任务中气味呈现阶段的 vTT 细胞活动模式。( A ) 气味引导的 go/no-go 任务示意图。行为时期从左到右按时间顺序推进。( B ) 气味引导的 go/no-go 任务中 vTT 的 Nissl 染色额叶切片（箭头表示记录轨道）和记录轨道（垂直粗线）。粉色区域显示 vTT 的第 II 层。APC，前梨状皮质；AON，前嗅觉核。比例尺：500 μm。( C ) 气味引导的 go/no-go 任务期间 vTT 细胞的示例发放模式。每行包含一次试验的尖峰（黑色刻度），与气味阀门打开的时间对齐（对应于气味端口进入，橙色刻度）。紫色和红色刻度分别表示气味阀门关闭和气味端口退出的时间。正确的试验按气味分组。在每个组中，正确的试验按气味采样时期的持续时间（从气味阀门打开到气味端口出口的时间）排序。直方图是所有气味的平均值，使用 20 毫秒的箱宽计算，并通过卷积脉冲序列与 60 毫秒宽的高斯滤波器进行平滑。垂直虚线表示气味阀门打开的时间。（D）上图：在气味呈现阶段（上图为通过试验；下图为未通过试验），放电率明显高于基线的细胞的 auROC 值。每行对应一个细胞，两个图中的细胞以相同的顺序显示。通过比较滑动箱（宽度，100 毫秒；步长，20 毫秒）中的 go 气味提示呈现和基线（提示前气味期，气味端口进入前 1.2 到 1 秒）或 no-go 气味提示呈现和基线来计算 auROC 值（通过气味阀门开启对齐）。通过比较每个细胞的 go 气味提示呈现和基线计算出的 auROC 值的峰值时间对细胞进行排序。垂直白线表示气味阀门开启的时间。颜色标度显示显著的 auROC 值（p<0.01，排列检验）。黑框表示 auROC 值不显著的箱（p>0.01，排列检验）。箭头指示与 ( C ) 中相同的细胞。下图：平均细胞 auROC 值。绿线表示 go 气味提示呈现与基线；粉色虚线表示 no-go 气味提示呈现于基线。阴影区域代表 95% 置信区间。垂直黑色虚线表示气味阀门打开的时间。请注意，在整个人群中，每个时间点的 go 和 no-go 气味提示呈现之间的平均 auROC 值没有显著差异（p<0.01，Welch t检验）。（E ）go 和 no-go 气味提示呈现之间的神经反应相似性测量。上图：一个细胞在 go/no-go 气味提示呈现阶段的 auROC 值示例（与（ C）中的细胞相同)) 和在 go/no-go-cue 气味呈现阶段 auROC 值的相关系数。下图：针对不同细胞对计算的相关系数和细胞改组数据的比较。来自同一神经元的配对反应 (红色) 的气味线索之间的神经元反应曲线比两个不同神经元的反应 (黑色) 更相似 (p<10 −13，双样本 Kolmogorov-Smirnov 检验)。

我们记录了 6 只小鼠在执行 go/no-go 任务时的 270 个 vTT 细胞的放电活动（表 1和2 ；记录位置如图 1B所示）。由于 vTT 直接从嗅球的僧帽细胞和丛状细胞接收输入，我们首先关注 vTT 细胞是否在气味呈现过程中表现出气味提示反应活动。我们观察到在 go 和 no-go 试验中，一部分 vTT 细胞在气味呈现阶段增加了其放电率（示例如图1C所示）。为了量化放电率对气味呈现阶段的依赖性，我们使用接收者操作特性 (ROC) 分析方法计算了滑动箱（宽度，100 毫秒；步长，20 毫秒）中从基线（气味提示前期，气味端口进入前 1.2 到 1 秒）的放电率变化。我们计算了每个时间段的 ROC 曲线下面积 (auROC)（尖峰数据与气味阀打开的开始时间对齐）。auROC 值的范围从 -1 到 +1，正值和负值分别反映相对于基线的增加和减少的发放率。我们进一步使用置换检验确定了 auROC 值显著性（参见材料和方法）。

表 1.气味引导的 go/no-go 任务中的基本信息。

表 2.气味引导的 go/no-go 任务中 vTT 细胞群的分布。

使用 auROC 方法，我们将气味提示反应群体（n = 68 个细胞，占记录细胞的 25%）定义为在正确的 go 或 no-go 试验中气味呈现阶段（气味阀打开后 500 毫秒）连续五个箱（100 毫秒）的放电率从基线显著增加的细胞。在所有细胞中，许多细胞相对于 go 和 no-go 气味提示呈现阶段都表现出放电率显著增加（图 1D中的顶部颜色图，p<0.01，排列检验）。在每个时间点的 go 和 no-go 气味提示阶段之间，这些增加的幅度没有显著差异（图 1D中的底部线，p>0.01，Welch t检验）。单个 vTT 细胞的放电率变化在 go 和 no-go 试验中表现出相似的时间过程。我们通过计算每个细胞正确的 go 试验和正确的 no-go 试验之间的反应谱的相关系数来量化这一点（图 1E中的顶线）。该分析表明，vTT 细胞的活动在 go 和 no-go 气味提示呈现阶段之间呈强烈相关，而不同的细胞对并没有表现出这种相关性（图 1E中的底线，p<10 −13，双样本 Kolmogorov-Smirnov 检验）。这些结果表明，单个 vTT 细胞并不代表气味呈现阶段 go 和 no-go 试验之间的气味提示差异。因此，我们假设放电活动主要反映动物行为，并且依赖于任务环境。

️2.2 气味引导的 go/no-go 任务中 vTT 细胞的行为特异性活动

在气味引导的 go/no-go 任务过程中，许多 vTT 细胞在特定行为期间表现出发放率增加 (图 2 - 图补充 1A )。行为事件之间的时间间隔 (从气味阀打开到老鼠将鼻子从气味口缩回的时间，以及从气味口缩回到奖励口进入的时间) 也因试验而异 (图 2 - 图补充 1A中的彩色阴影区域)。为了开发一个解释这种变化的整体发放曲线，我们创建了事件对齐尖峰直方图 (EASH)。EASH 是通过线性缩放每次试验中行为事件之间的时间间隔和所有试验的中位间隔得出的 (图 2 - 图补充 1B，见材料和方法)。EASH 清楚地证明了单个 vTT 细胞在不同的行为时期（事件间隔）被激活，例如当老鼠在接近时期戳气味口时（左下图，图 2A）和在气味采样时期（左下图第二张图，图 2A）。

图 2.在气味引导的 go/no-go 任务中，vTT 细胞对不同行为进行调节。( A ) 左图：针对特定行为调整的五个代表性细胞的事件对齐尖峰数据示例。使用 20 ms 箱宽计算事件对齐尖峰直方图，并通过将尖峰序列与 60 ms 宽的高斯滤波器卷积进行平滑。灰色阴影表示接近时期（进入气味端口前 500 ms），黄色阴影表示气味采样时期（从进入气味端口到离开气味端口），橙色阴影表示移动时期（从离开气味端口到进入水端口），浅蓝色阴影表示等待时期（水奖励延迟，打开水阀前 300 ms），蓝色阴影表示饮水时期（打开水阀后 1000 ms）。右图：根据所有细胞的事件对齐尖峰数据（按气味阀打开对齐）计算 auROC 值，按 auROC 值的峰值时间排序。每行对应一个单元格。通过在滑动箱（宽度，100 毫秒；步长，20 毫秒）中比较正确的 go 试验与基线（气味提示前期，气味端口进入前 1.2 到 1 秒）来计算 auROC 值。垂直白线表示行为时期之间的转换，包括气味端口进入（对应气味阀打开）、气味端口退出、水端口进入和水阀打开。此图的颜色比例与图 1D中使用的相同，正值和负值分别反映相对于基线增加和减少的发放率。（B）在气味引导的 go/no-go 任务中，每个细胞组的显著 auROC 值的相对分布（p<0.01，排列检验）针对特定行为时期进行了调整。细胞组针对接近、气味采样、移动、等待和饮水时期进行了调整（从下到上的图表）。每条线对应一个细胞（左轴，auROC 值）。黄色和蓝色分别表示相对于基线显著增加和减少。灰色表示既没有显著增加也没有显著减少。阴影区域显示显著 auROC 阀的相对分布（右轴，概率，参见材料和方法）。红点表示时间段包含的具有显著反应的细胞比 1000 个重采样数据集的分布中更多。蓝点表示时间段包含的具有显著反应的细胞比 1000 个重采样数据集的分布中更少。重采样数据集如图 2 所示——源数据 1。垂直黑线表示气味口进入（对应气味阀打开）、气味口退出、水口进入和水阀打开的时间。注意，每个细胞组对特定的行为时期表现出兴奋反应，而相对于其他时期则表现出抑制反应。

为了量化 go 试验期间行为时期的神经活动，我们使用 ROC 分析计算了滑动箱（宽度，100 毫秒；步骤，20 毫秒）中事件对齐发放率从基线（气味提示前期，气味端口进入前 1.2 到 1 秒）的变化。在整个群体中，几乎所有 vTT 细胞在每个时期的特定行为过程中都表现出发放率显著增加（图 2A中的右侧颜色图）。此外，单个 vTT 细胞在某些时期表现出发放率显著下降。这些结果与计算 auROC 值的窗口大小无关 (图 2 -图补充 2 )。为了评估特定时期发放率之间的关系，根据五个 go 试验行为时期，vTT 细胞根据其调谐峰值时间分为五组 (图 2 -图补充 3，见材料和方法)。对于每个细胞组，我们根据整个任务过程中放电率的显著增加或减少变化（图 2B ），计算了每个箱体的显著反应相对分布（图 2—图补充 4 ，见材料和方法） 。在 vTT 细胞中，7% 在接近时期的时间窗内表现出调节峰值时间，表明在接近时期表现出放电率增加的概率显著更大；24% 在气味采样时期具有调节峰值时间，表明这些细胞的放电率在气味采样时期增加；23% 和 11% 分别在移动和等待时期具有调节峰值时间，表明这些细胞对每个时期都进行了调节；15% 在饮水时期具有调节峰值时间，表明它们对饮水时期进行了调节。此外，我们观察到这些分类细胞在其他行为时期的活动趋于降低，这表明单个 vTT 细胞针对特定的目标导向行为表现出不同的调节特性。

️2.3 气味引导的进食/不进食任务中 vTT 细胞的行为特异性活动

我们观察到 vTT 细胞的活动在数百毫秒的时间尺度上随行为时期而发生调节（图 2）。随后我们研究了如果将行为时期延长至数秒的时间尺度，vTT 细胞在每个时期会如何反应。此外，我们还评估了 go/no-go 任务中 vTT 细胞的活动模式是否可以推广到不同的情境和动机行为。为此，我们进行了以气味为引导的进食/不进食任务，并提供食物奖励（图 3A）。对小鼠进行食物限制计划，并训练它们选择食用盘子中的食物或通过盘子气味提示避免食用食物。我们随机在盘子中放入糖，并加入三种不同气味提示（丁香油酚、香草精或杏仁精）中的一种。然后将盘子放在测试笼中的任意位置。在学习阶段，丁香酚和香草精气味与糖奖励相关，而杏仁精气味则与糖奖励相关，随后是厌恶后果（注射氯化锂）。学习阶段结束后，如果出现丁香酚或香草精气味（进食试验），小鼠就会接近盘子并开始食用其内容物。在进食试验中，在小鼠开始进食约 6 秒后，即使动物仍在进食，也会将盘子撤走。小鼠在进食试验过程中始终表现出的行为顺序包括接近（接近食物盘）、进食（从接触盘子到进食）和食物撤走后的逃避行为（图 3A）。相反，如果出现杏仁精气味（例如在不进食试验期间），小鼠会接近盘子但不会食用其内容物（图 3A，不进食）。在随机交错的试验中，也会在盘子上呈现粉状（正常）食物。在所有会话中，提示性气味试验和粉末食物试验的行为反应准确度分别为丁香油酚、香草精、杏仁精和粉末食物试验的 0.93 ± 0.01、0.90 ± 0.01、0.96 ± 0.01 和 0.99 ± 0.003（平均值 ± SEM，来自六只小鼠的 63 个会话）。

图 3.在气味引导的进食/不进食任务中，vTT 细胞会调整至不同的行为。( A ) 气味引导的进食/不进食任务示意图，行为时期从左到右推进。( B ) 左图：针对三个代表性细胞针对特定行为进行调整的事件对齐尖峰数据示例。事件对齐尖峰直方图是使用 500 ms 箱宽计算的，并通过将尖峰序列与 500 ms 宽的高斯滤波器卷积进行平滑。灰色阴影表示接近时期（从开始接近行为到接触培养皿），粉色阴影表示进食时期（从开始食用到移除食物），浅绿色阴影表示移除食物时期（移除食物后 2 秒）。右图：根据所有细胞的事件对齐尖峰数据（与接触培养皿对齐）计算出的 auROC 值，按 auROC 值峰值的时间排序。每行对应一个细胞。通过在滑动箱（宽度，500 毫秒；步长，100 毫秒）中比较进食试验与基线（接近前时期，开始接近行为前 3 到 1 秒）来计算 auROC 值。垂直白线表示动物接触盘子的时间（左）和移走食物的时间（右）。颜色标度表示正值，反映相对于基线的发放率增加，而负值反映相对于基线的发放率降低。（C）在气味引导的进食/不进食任务中，每个细胞组中针对特定行为的显著 auROC 值（p<0.01，排列检验）的相对分布。细胞组针对接近时期、进食时期和食物移除时期进行了调整（从图的底部到顶部）。每条线对应一个细胞（左轴，auROC 值）。黄色和蓝色分别表示相对于基线的显著增加和减少；灰色表示不显著的增加或减少。阴影区域表示显著 auROC 阀的相对分布（右轴，概率，见材料和方法）。红点表示时间段包含的具有显著反应的细胞比 1000 个重采样数据集的分布中更多。蓝点表示时间段包含的具有显著反应的细胞比 1000 个重采样数据集的分布中更少。重采样数据集在图 3 中提供 - 源数据 1。垂直黑线表示老鼠接触培养皿的时间（左）和食物被移除的时间（右）。注意每个细胞组对特定的行为时期都有兴奋反应，而相对于其他时期的反应则受到抑制。

当小鼠执行气味引导的进食/不进食任务时，我们记录了 6 只小鼠的 374 个分离良好的 vTT 细胞的尖峰活动（表 3和4 ，记录位置如图 3—图补充 1所示）。我们观察到，在气味引导的进食试验中，大多数 vTT 细胞在特定行为期间表现出放电率增加。图 3B（左侧）中的图表显示了行为特异性 vTT 细胞的例子，这些细胞在每个行为时期的放电率大大增加。小鼠在任务期间的行为持续时间（接近、进食和其他行为，如运动、梳理和移走盘子时冻结）在不同的试验中有所不同（图 3—图补充 2A）。我们为气味引导的进食/不进食任务的行为时期生成了 EASH，以开发一个考虑行为时间变化的整体放电概况（图 3—图补充 2B）。EASH 清楚地表明，单个 vTT 细胞在不同的行为时期被激活，例如在接近时期接触培养皿期间（左下图，图 3B）和进食时期（左下图第二张图，图 3B）。

表 3.气味引导的进食/不进食任务的基本信息。

表4.气味引导的进食/不进食任务中 vTT 细胞群的分布。

为了量化行为时期调节的神经活动，我们使用 ROC 分析方法计算了滑动箱（宽度，500 ms；步长，100 ms）中事件对齐发放率从基线（接近前时期，接近行为开始前 3 到 1 秒）的变化。如图3B所示，大多数 vTT 细胞在特定行为时期表现出发放增加，而在另外两个行为时期表现出发放减少。这些结果与计算 auROC 值的窗口大小无关 (图 3-图补充 3 )。为了评估这些不同的模式，我们根据三个不同的饮食试验行为时期的调谐峰值时间将单个 vTT 细胞分为三类。这些分析表明，19%、20% 和 12% 的 vTT 细胞在接近、进食和移除食物时期分别具有调节峰值时间，这表明这三类细胞对特定且不同的行为进行了调节。

为了评估这些细胞亚型在进食试验中的发放模式，我们根据整个任务过程中发放率的显著增加或减少变化，计算了每个箱体中显著反应的相对分布（图 3C）。对于每个细胞组，在最喜欢的时期（即 vTT 细胞具有峰值调节时间的时期），每个箱体中发放率显著增加的出现概率明显高于细胞混洗数据的概率。发放率显著降低的箱体的出现概率往往出现在其他时期。这些结果表明，vTT 细胞在数秒的时间尺度上对特定的气味引导的进食行为进行了调节。

为了解决进食阶段细胞放电增加是否是由食物菜肴的气味引起的，我们比较了进食阶段中调节峰值时间的细胞在丁香油酚、香草精和粉末食物呈现期间的平均细胞 auROC 值 (图 3—图补充 3 )。我们观察到香草精和粉末食物呈现之间放电率增加的显著差异。在丁香油酚和香草精呈现之间或丁香油酚和粉末食物呈现之间，放电率增加没有显著差异，这意味着 vTT 细胞在进食阶段行为期间增加放电的方式与气味提示类型基本无关。

️2.4 不同气味引导任务中 vTT 细胞行为特异性活动的比较

为了进一步确定不同任务中 vTT 细胞活动的共同特性，我们首先评估了任务间 vTT 细胞的发放特性。在任务间未观察到基线发放率的显著差异（图 4—图补充 1A，p>0.05，Wilcoxon 秩和检验）。在每个最喜欢的时期，分类细胞群的平均发放率没有显著差异（图 4—图补充 1B，p>0.05，Tukey 检验）。对两个任务中分类细胞的解剖分布的分析揭示了 vTT 内的分布模式不同（图 4—图补充 2和3）。然后，我们描述并比较了最喜欢的时期内 vTT 的发放时间长度和峰值发放位置。我们研究了 vTT 细胞的调节持续时间（图 2—图补充 3，见材料和方法）是否与行为时期的实际持续时间相对应。从 go/no-go 任务中选择了三个行为时期（气味采样、移动和等待）。还根据每次试验中行为时期的精确定义开始和结束时间，评估了进食/不进食任务的接近和进食时期。然后，我们比较了每个时期的调节持续时间与行为持续时间的分布。神经数据的中位数与行为数据的中位数呈正相关（r = 1.00，p<10 −3，图 4A），这表明 vTT 细胞中持续放电的持续时间取决于行为时期的持续时间。然后，我们检查了调节峰值时间与任务时间进程的关系。我们将 vTT 细胞的调节峰值时间作为任务时间进程的函数（图 4B，顶部）。我们观察到，vTT 调节峰值时间的范围几乎涵盖了气味引导的奖励导向行为的整个连续行为时期系列。因此，调整持续时间与所有任务时期重叠。

图 4.不同任务中 vTT 细胞的调节持续时间和调节峰值时间。( A ) 神经调节持续时间中位数与行为时期持续时间中位数之间的相关性（r = 1.00，p<10 −3，误差线显示四分位距）。右侧直方图显示每个行为时期的神经调节持续时间分布（浅蓝色，调节到接近时期的细胞组；紫色，调节到进食时期的细胞组；绿色，气味采样时期；蓝色，移动时期；红色，等待时期）。右侧图中的垂直黑线显示每个时期的中位调节持续时间。（B）具有调节峰值时间的细胞对调节峰值时间和调节持续时间的响应曲线（气味引导的 go/no-go 任务，217 个细胞；气味引导的吃/不吃任务，192 个细胞）。上图：气味引导的 go/no-go 任务和气味引导的吃/不吃任务中的调谐峰值时间（橙色圆点）和调谐持续时间（黄色水平线）。垂直白线表示行为时期之间的转换。中间图：任务时间过程中调谐峰值时间的分布。阴影显示调谐峰值时间分布。垂直黑线显示行为时期之间的转换。下图：兴奋性调谐持续时间的分布，定义为具有 2-D 高斯平滑核的连续显著区间的持续时间（p<0.01，置换检验）。垂直白线表示行为时期之间的转换。颜色标度表示任务中每个调谐持续时间的细胞数量。

我们还观察到，在转换到下一个行为时期时，调谐峰值时间的分布趋于增加，例如当动物在去/不去任务期间探索气味和水口时，或者在进食/不进食任务中到达或离开盘子时（图4B，中间）。此外，在行为时期转换前后具有调谐峰值时间的一部分细胞往往具有较短的调谐持续时间（图4B，底部），表明转换前后存在阶段性活动。事实上，在进食时期，调谐持续时间的分布呈现双峰模式（图4A，图4 -图补充4）。大多数阶段性反应往往位于进食时期的末尾。总的来说，这些结果表明，在目标导向行为期间，单个vTT细胞被调谐到特定的时间窗口（调谐持续时间和调谐峰值时间）。

️2.5 vTT 细胞的行为情境相关活动

我们观察到许多 vTT 细胞在最喜欢的行为时期之前倾向于增加其发放率，而一些细胞在该时期之后保持其增加的发放率（图 2B、3C和4B）。因此，我们假设单个 vTT 细胞发放与特定的行为环境相适应，因此依赖于任务进展过程中的特定任务元素而不是特定行为。如果这是真的，那么 vTT 细胞的反应模式会在不同的环境下发生变化，即使是对于相同的行为。我们评估了气味引导的 go/no-go 任务的气味采样时期的鼻戳行为，并观察到尽管涉及相同的鼻戳行为，但在动物离开气味口之前，一组细胞在 go 和 no-go 试验之间表现出发放率差异。我们使用实时数据的 ROC 分析计算 go-提示与 no-go-提示试验偏好，从而量化了这一点。当放电率差异与气味端口退出时间对齐时，我们观察到，与气味呈现阶段相比，动物离开气味端口之前的 go 和 no-go 试验中放电率差异更大的细胞 (图 5A )。调节峰值时间不在气味采样时期的一组细胞也在气味端口退出时间之前表现出放电率差异。

图 5.vTT 细胞的行为环境特定活动。( A ) 上图：在气味引导的 go/no-go 任务中，气味采样时期周围所有细胞的 auROC 值。每行对应一个细胞。在滑动箱（宽度，100 毫秒；步长，20 毫秒）中，针对正确的 go 试验与正确的 no-go 试验计算了 auROC 值（左，与气味阀门开口对齐；右，与气味端口出口对齐）。这些值根据右图中峰值 auROC 值的时间进行排序。垂直白线表示气味端口出口的时间。颜色标度表示显著的 auROC 值（p<0.01，排列检验）。黑框表示 auROC 值不显著的箱。下面板：在每个时间段内表现出显著 auROC 值 (p<0.01，排列检验) 的细胞数（橙色，调整到接近时代的细胞组；绿色，气味采样时代；蓝色，移动时代；红色，等待时代；棕色，饮水时代）。（B）气味引导的 go/no-go 任务中气味解码准确度的时间过程。由滑动窗口 (宽度，100 毫秒；步骤，20 毫秒) 中 270 个神经元的瞬时尖峰计数组成的向量用作分类器的输入。在每个时间点都进行分类器的训练和测试。橙线表示行为表现水平。灰线和阴影区域表示从 1000 个试验标签打乱的数据集计算出的控制解码准确度的平均值±2 SD。打乱后的数据集在图5中提供 -源数据1。顶部星号表示准确度大于平均值 + 2SD。

为了检验 vTT 细胞群活动是否可以解释行为准确性，我们进行了解码分析，以确定 vTT 细胞群的发放率是否可用于将每次单独试验分类为通过或未通过。我们使用具有线性核的支持向量机作为解码器。使用滑动时间窗对所有 270 个细胞的解码时间过程进行分析，结果显示，在气味呈现期间，解码准确性保持在偶然水平，随后增加到接近气味端口退出前行为准确性所达到的水平（图 5B）。这些结果表明，在目标导向行为期间，vTT 细胞会对特定行为环境中的任务元素进行调节。

️2.6 vTT 细胞的类型和连接模式

尽管 vTT 第 II 层的大多数神经元由锥体细胞组成，但 vTT 还包含其他细胞类型。为检查谷氨酸能细胞和 GABA 能细胞在 vTT 中的分布，我们进行了原位杂交以测量 vTT 中的囊泡谷氨酸转运蛋白 1（VGluT1）和谷氨酸脱羧酶（GAD）67 和 GAD65 mRNA（分别为Slc17a7和Gad1/2 mRNA）（图 6A、B）。大约 86% 和 8% 的 vTT 细胞分别为Slc17a7阳性和Gad1/2阳性，这表明 vTT 的主要神经元是谷氨酸能神经元。

图 6.vTT 细胞的细胞类型和连接模式。( A ) Slc17a7 (上图) 和Gad1/2 (下图) mRNA的原位杂交以及 Neurotrace 对 vTT 细胞的染色。比例尺，100 μm。( B ) vTT (n = 3 只小鼠) 中 Neurotrace 阳性细胞中Slc17a7阳性细胞 (左栏) 和Gad1/2阳性细胞 (右栏) 的平均百分比。误差线表示 SEM。( C ) 左上：注射 Alexa 555 结合霍乱毒素 B 亚基 (CTB，红色) 后的 vTT 冠状切面。比例尺，500 μm。其他五个图显示在 vTT 中注射 CTB 后 CTB 标记的细胞。mPFC，内侧前额皮质；OB，嗅球；AON，前嗅核；APC，前梨状皮质；PPC，后梨状皮质。比例尺，100 μm。( D ) 每个区域 CTB 标记细胞体的平均密度（mPFC，n = 5 来自三只小鼠；OB，n = 5 来自三只小鼠；AON，n = 3 来自两只小鼠；APC，n = 5 来自三只小鼠；PPC，n = 5 来自三只小鼠）。误差线表示 SEM。( E ) 将 CTB 注射到 mPFC（左上）、OB（中上）、AON（右上）、嗅结节（OT，左下）、APC（中下）和 PPC（右下）后 CTB 标记的 vTT 细胞。比例尺，100 μm。( F ) vTT 中逆向标记的 CTB 阳性细胞的平均密度（n = 3 来自两只小鼠）。误差线表示 SEM。( G ) vTT 连接模式示意图。箭头表示轴突投射。

之前有报道称，vTT 与嗅球 (OB)、前梨状皮质 (APC) 和后梨状皮质 (PPC) 有相互连接。此外，vTT 的深层从内侧前额皮质 (mPFC) 接收自上而下的输入。为了进一步检查投射到 vTT 的皮质区域，我们向小鼠 vTT 中注射了一种逆行示踪剂，即与 Alexa 555 结合的霍乱毒素 B 亚基 (CTB) (图 6C )。在 OB、APC、PPC 和 mPFC 中鉴定出许多逆行标记 (CTB 阳性) 的细胞体。相反，在位于 vTT 背侧的前嗅觉核 (AON) 中很少观察到 CTB 阳性细胞体 (图 6D )。

为了检查从 vTT 细胞接收轴突投射的皮质区域，我们将 CTB 注射到 mPFC、OB、AON、嗅结节 (OT)、APC 和 PPC。然后，我们对 vTT 中逆向标记的 CTB 阳性细胞进行了量化 (图 6E、F )。在 OB、AON 和 APC 中接受 CTB 注射的小鼠中观察到许多逆向标记的 vTT 细胞。相反，在 OT 和 PPC 中接受 CTB 注射的小鼠中仅观察到少量逆向标记的 vTT 细胞。此外，在 mPFC 中注射 CTB 后，vTT 中的逆向标记细胞很少。这些结果表明，除了与 OB 的紧密相互连接之外，vTT 还投射到 AON 和 APC，并接收来自 APC、PPC 和 mPFC 的自上而下的投射 (图 6G )。

️ 三、讨论

在本研究中，我们报告了自由活动小鼠在执行气味引导行为时 vTT 中的神经元活动记录。我们描述了小鼠在执行两种气味引导的目标导向行为任务时 vTT 细胞的神经活动。我们的结果表明，在目标导向任务的行为背景下，单个 vTT 细胞对特定时间窗口具有特征性调节。

️3.1 vTT 细胞中的气味表征

在气味引导的 go/no-go 任务中，25% 的 vTT 细胞在学习到的气味呈现阶段表现出增加的放电（图 1）。尽管这些 vTT 细胞中的许多在气味出现后约 100 毫秒表现出峰值放电，但它们并没有在气味呈现阶段编码学习到的气味差异（图 1E）。在小鼠进行行为选择时，气味口出口之前出现了一组细胞的放电率差异（图 5）。这些特征类似于在梨状皮质中观察到的学习到的气味引导任务的反应模式。然而，许多 vTT 细胞在气味呈现之前就增加了放电率（图 1D、2B和4B），并且单个 vTT 细胞表现出以峰值调谐和调谐持续时间为特征的特定调谐模式。因此，我们假设vTT细胞的放电活动主要反映动物行为，并且依赖于任务环境。

️3.2 vTT 中的情境相关神经活动

在本文使用的气味引导的 go/no-go 任务中（图 2），vTT 细胞表现出特定的放电率，以适应 go 试验的每个行为时期（例如移动到气味端口、在气味端口采样气味、移动到水奖励端口、等待奖励和获得水奖励）。此外，这些细胞倾向于在除最喜欢的时期之外的时期抑制其放电活动。

为了评估 vTT 细胞的情境相关调节，我们采用了不同的气味引导任务。我们根据气味引导的进食/不进食任务期间发生的放电模式差异确定了三种独特的细胞亚型（图 3）。一种细胞类型在小鼠接近盘子时放电显著增加，但在进食和移走食物时往往保持沉默。另一种细胞亚群在小鼠接近盘子、进食和移走盘子时放电更多。vTT 细胞也倾向于在除其最喜欢的时期以外的行为时期抑制放电。

在各个任务中，我们观察到每个行为时期的调节持续时间与行为时期的持续时间相关。此外，调节峰值时间的位置在行为任务的时间过程中有所不同（图 4）。此外，许多细胞在时期之间的转换中表现出短暂的活动持续时间，暗示它们在连接两个时期中起着作用（图 4B）。此外，我们观察到在气味采样时期调节的 vTT 细胞在气味端口撤回之前在 go 和 no-go 试验之间表现出不同的活动（图 5），这意味着单个 vTT 细胞在任务调节的行为环境中适应特定的时间窗口，而不是适应特定的行为。

总的来说，这些结果表明每个 vTT 细胞都有独特的行为和情境相关偏好，通过调节峰值时间和调节持续时间来证明。vTT 细胞的这些特性可能有助于在 vTT 中气味引导行为期间表征一系列特定的行为情境信息 (即一个情节)。当 vTT 细胞将其轴突发送到其他嗅觉皮层区域，如 AON 和梨状皮层 (图 6） 时，我们推测 vTT 可能向广泛的嗅觉区域提供有关某些行为情境中行为瞬时变化的信息。事实上，在 OB 中的僧帽细胞中观察到了情境相关的神经活动调节，OB 是一个在进行气味强化关联学习期间从 vTT 接收直接输入的区域。

我们推测来自其他高级脑区的行为情境相关输入可能有助于 vTT 细胞的情境相关活动，因为很难解释行为情境相关活动如何可能仅由自下而上的嗅觉感官输入引起。vTT 从 mPFC 接收自上而下的直接输入以及从其他嗅觉皮层区域接收间接输入（图 6 ）。具体来说，当动物在不同环境情境之间移动时 ，mPFC 神经元参与情境编码，并在涉及气味位置匹配的工作记忆任务中优先在迷宫轨迹中的特定位置激发。结合本文提供的证据，这些发现表明，mPFC 的情境特定活动可能有助于 vTT 中情境相关活动的产生。此外，Allen 等人。最近报道，气味线索诱导的奖励预测反应并不局限于嗅觉皮层，而是发生在整个大脑中，包括感觉、运动和前额叶皮层以及皮层下区域。这表明情境依赖性细胞位于整个大脑中，它们的活动可能驱动大脑中的特定信息处理模式。在这方面，vTT 可能在嗅觉区域的特定信息处理模式中发挥重要作用，它充当枢纽、放大器或整流器，将情境依赖性信号从 mPFC 发送到广泛的嗅觉区域。

根据任务行为时期的发放模式，我们将 vTT 细胞分为五种细胞类型，分别用于气味引导的 go/no-go 任务和气味引导的吃/不吃任务。这些细胞的调节持续时间与行为时期持续时间密切相关（图 4A）。然而，进食时期的细胞调节持续时间呈现双峰分布，即一些细胞表现出持续几乎整个进食时期的调节持续时间，而其他细胞则表现出短暂的阶段性反应。此外，vTT 细胞的神经活动并不总是局限于特定时期。例如，许多在进食时期增加发放率的细胞在此时期之前就开始发放（图 3和4B）。此外，单个 vTT 细胞表现出独特的调节持续时间和调节峰值时间（图 4B）。我们推测，vTT 细胞的一个子集会适应特定行为环境中涉及瞬时变化的较小规模行为或任务元素。例如，vTT 细胞在时间段转换时（尤其是在进食/不进食任务中）表现出峰值放电，可能编码运动的启动。

️3.3 vTT 细胞对内部状态的假定编码

在气味引导的目标导向任务中，许多 vTT 细胞在最喜欢的行为时期开始之前增加了它们的放电率（图2、3、4和5 ）。这些观察证实了这样一种观点，即vTT 细胞活动既受正在进行的行为期间的信号调节，也受对未来行为的预测调节。尽管在气味引导的 go/no-go 任务中，大量 vTT 细胞在气味呈现期间增加了它们的放电率，但它们的平均放电率在 go 和 no-go 试验之间并没有显著差异。事实上，放电率差异在小鼠离开气味口之前就出现了。我们推测，在预测未来行为的过程中，vTT 细胞活动不是由正在进行的行为期间的嗅觉感官输入直接驱动的；相反，它是由梨状皮质和来自前额皮质（包括 mPFC）和杏仁核中更高级的认知和动机中心自上而下的输入直接或间接引起的。这些区域在气味识别、气味辨别、动机、奖励预测和决策中发挥着关键作用。在气味引导的进食/不进食任务的进食时期，vTT 细胞根据不同的线索类型以不同的强度激发（图 3—图补充 4）。这些反应特征可能是由呈现的奖励味道的适口性变化所支持的，因为小鼠在进食过程中同时受到嗅觉和味觉刺激。基于这些结果，我们推测 vTT 细胞的激发模式受外部环境和内部状态的影响。

️3.4 研究局限性

尽管本研究有其优势，但它并未阐明自上而下的输入是否或如何影响特定行为情境中的 vTT 细胞。此外，我们并未阐明 vTT 细胞如何整合自下而上和自上而下的输入。需要进一步研究选择性抑制自上而下的输入或嗅觉输入，以剖析 vTT 细胞在气味引导的消费行为中的功能作用。

️ 四、材料和方法

️4.1 动物对象

所有实验均在雄性 C57BL/6 小鼠（9 周龄；体重 20-25 克）身上进行。小鼠被单独饲养在金属笼子（13.5 × 23 × 17 厘米）中，笼子温度可控，光照时间为 13 小时/黑暗时间为 11 小时（8:00 开灯，21:00 关灯）。除行为任务期间外，可随意获取食物和水。所有实验均按照同志社大学动物实验指南进行，并经同志社大学动物研究委员会批准。

️4.2 气味引导的通过/不通过任务

对于气味引导的通过/不通过任务（图 1A），我们使用了由 Bpod 状态机 r0.5控制的行为装置，这是一种专为行为任务设计的开源控制设备。该装置包括一个定制设计的小鼠行为盒（14 × 17 × 15 厘米），前壁上有两个鼻戳口。盒子封闭在一个隔音箱内，配有通风风扇以提供足够的空气流通和低水平的背景噪音。每个鼻戳口都配有一个白色发光二极管 (LED) 和红外光电二极管。红外光束的中断会产生晶体管-晶体管逻辑 (TTL) 脉冲，从而发出小鼠头进入端口的信号。气味输送口配有不锈钢管，连接到定制的嗅觉计。丁香酚和乙酸戊酯（东京化学工业株式会社，日本东京）分别用作通行和不通行气味提示。这些气味在矿物油中稀释至 10%，然后用气流（1.8 L/min）进一步稀释 1:9。水奖励输送基于重力流，由电磁阀控制，并通过 Tygon 管连接到不锈钢管。奖励量（6 μL）由电磁阀打开的持续时间决定，并定期校准。

对于气味引导的“去/不去”任务，小鼠（n = 6）被限制饮水 1-2 mL/天，并每天监测体重，以确保其体重保持在限制饮水前的 80% 以内。在训练期间，小鼠学会在左侧饮水口获得水奖励，从右侧气味口移动到左侧气味口，并将气味线索与正确的动作联系起来。每次试验都以右侧气味口的 LED 灯亮起开始，这作为小鼠将鼻子伸入该口的信号。将鼻子伸入气味口会导致传递两个气味线索之一，持续 500 毫秒。小鼠需要在气味刺激期间保持鼻子探入以嗅闻气味。气味刺激后，LED 灯关闭，小鼠可以将鼻子从气味口缩回。如果呈现丁香酚气味（进入气味提示），则要求小鼠在 2 秒的超时时间内移动到左侧水奖励口并用鼻子戳进去。在水口，要求小鼠保持鼻子戳进去 300 毫秒，然后开始供水。接下来，提供 6 μL 水作为奖励。如果呈现乙酸戊酯气味（不进入气味提示），则要求小鼠在气味刺激后 2 秒内避免进入水口。平均试验间隔 (ITI) 为 3 秒。

️4.3 气味引导进食/不进食任务

对于气味引导的进食/不进食任务（图 3A），将小鼠（n = 6）限制进食 3-4 克/天，并每天监测体重，以确保其体重保持在限制前体重的 80% 以内。在训练期间，小鼠学会将气味与蔗糖奖励联系起来。训练在塑料笼子（38.5 × 33.5 × 18 厘米，）中进行，笼子内有原生纸浆垫料。在隔音室中使用摄像机监控笼子，隔音室配有通风风扇，可提供空气循环和低水平的背景噪音。在带孔的培养皿中向小鼠展示 1-2 克砂糖，培养皿内有一张浸有气味（40 μL）的滤纸（2 × 2 厘米）。培养皿在笼子中的任意位置用垫料覆盖。气味线索是丁香酚（东京化学工业株式会社，日本东京）和香草精，在矿物油中稀释至 10%。在初始训练课程中，气味试验是随机呈现的。在了解了盘子、气味和糖奖励之间的关联后，老鼠会接近并触摸盘子，挖开上面的垫料，然后开始食用蔗糖。由于我们使用了大垫料（每个垫料的尺寸约为 10 × 5 毫米），垫料没有与蔗糖完全混合。它们可能会有些混在一起，但每次试验前，蔗糖上都会覆盖少量新垫料，这样如果不挖开垫料，就无法接触到蔗糖。老鼠至少需要七次初始训练课程。

在最初的训练课程之后，训练小鼠将杏仁香精气味（稀释至 10% 的矿物油）与厌恶后果（不适）联系起来。这是通过让小鼠接近有杏仁香精气味的盘子并食用盘子中的蔗糖 1 小时来实现的，之后给小鼠腹膜内注射 0.5 M 氯化锂 (LiCl, 0.01 mL/g)。注射 LiCl 后，小鼠会继续接近有杏仁气味的盘子，但不会食用蔗糖（不进食反应）。在一次训练中就建立了不进食反应。

经过条件性厌恶训练后，检查了气味引导的进食/不进食任务中的表现。蔗糖随机呈现在带有三种不同气味提示（丁香油酚、香草精或杏仁精）之一的盘子上。杏仁精气味呈现的概率为 20%。粉末食物也呈现在盘子中，在试验中呈现的概率为 20%。在小鼠开始进食后约 6 秒，盘子突然被移除。明确未确定试验间隔 (ITI)，以增加事件的不可预测性。对于丁香油酚、香草精和粉末食物试验，正确的试验定义为接近和消耗。对于杏仁精试验，正确的试验定义为接近但不消耗或在盘子呈现后至少 30 秒内不接近。在对小鼠进行良好训练后，它们的行为准确性在整个会话期间保持在 80% 以上。小鼠每天进行 40-60 次任务试验。

️4.4 电生理学

用美托咪啶（0.75 mg/kg ip）、咪达唑仑（4.0 mg/kg ip）和布托啡诺（5.0 mg/kg ip）对小鼠进行麻醉，并在 vTT 中植入定制的三或四个四极管微驱动器（距前囟门 2.6 mm，距中线 0.4 mm，距脑表面 4.0 mm）。单个四极管由四根扭曲的聚酰亚胺涂层钨丝（单丝直径 12.5 μm，镀金至小于 500 kΩ）组成。四极管的尖端和侧面涂有 DiI。将另外两个螺钉拧入小脑上方的骨骼中以供参考。电极连接到微驱动器上的电极接口板（EIB-18）。使用 LOCTITE 454将微驱动器阵列固定在颅骨上。手术完成后，小鼠接受阿替美唑（0.75 mg/kg ip）以逆转美托咪啶的作用并缩短恢复期。术后给予止痛药（酮洛芬，5 mg/kg，ip）。手术后至少 1 周恢复行为训练。

电信号是通过 Cheetah 记录系统或开源硬件 (Open Ephys) 获得的。对于单元记录，信号在 NeuraLynx 中以 32 kHz 采样，在 Open Ephys 中以 30 kHz 采样，并在 600-6,000 Hz 下进行带通滤波。每次记录后，通过转动微驱动器的螺丝将四极管降低 20、40 或 75 μm 以上以获得新单元。

️东莞富临医疗科技有限公司是Open Ephys 和 Intan Technologies 在亚洲的代理商，富临医疗为亚洲客户提供“技术服务”与“电生理产品”

️4.5 数据分析

所有数据分析均使用 MATLAB 2019a的内置软件执行。

️4.6 行为数据分析

对于气味引导的去/不去任务，准确率计算为一次会话中去和不去试验成功反应的总百分比。小鼠每天在每个会话中进行最多 600 次试验。对于气味引导的进食/不进食任务，准确率计算为小鼠成功食用搭配丁香酚或香草精气味的蔗糖、成功食用粉末食物或未食用搭配杏仁精气味的蔗糖的平均试验百分比。小鼠每天在每个会话中进行 40-60 次试验。

️4.7 尖峰分类

使用自动脉冲分离算法 KlustaKwik ，根据脉冲的波形能量、峰值幅度和来自四个四极管通道的第一个主成分，离线将脉冲分类为簇。使用 MClust 软件 手动校正和细化所得分类。仅当满足以下条件时，簇才被视为单个单元：(1) 不应期 (2 毫秒) 违规少于所有脉冲的 0.2% 和 (2) 隔离距离（估计为基于马哈拉诺比斯距离的从已识别簇中心到最近簇的距离）大于 20。为了检查 vTT 细胞放电模式的行为相关性，我们选择了试验期间平均放电率大于 0.3 Hz 的 vTT 细胞进行进一步分析。

️4.8 脉冲序列分析

在气味引导的继续/不继续任务中，通过将每个事件时间戳从 Bpod 行为控制系统输入电信号记录系统来同步神经和行为数据。为了计算任务期间的发放率，使用 20 ms 箱宽计算事件周围时间直方图 (PETH)，并通过用 60 ms 宽的高斯滤波器卷积脉冲序列进行平滑（图 1C 和图2—图补充 1A中的底线）。在气味引导的进食/不进食任务中，从记录的行为视频帧中获取每个事件（开始接近盘子、首次接触盘子和移开盘子）的时间戳，这些时间戳与脉冲数据同步。为了计算任务期间的细胞发放率，使用 500 ms 箱宽计算 PETH，并通过用 500 ms 宽的高斯滤波器卷积脉冲序列进行平滑（图 3—图补充 2A）。

️4.9 事件对齐尖峰直方图

为了检验行为任务中各个 vTT 细胞的发放率变化与行为时期发展之间的关系，我们生成了 EASH。由于每次试验的行为时期持续时间不同，因此首先计算中位时期持续时间。在气味引导的 go/no-go 任务中，气味采样时期的中位持续时间（从出现 go 气味提示到离开气味端口）为 839 毫秒，移动时期的中位持续时间（从气味端口出口到水端口入口）为 455 毫秒。每个时期和每次试验的脉冲时间都经过线性变换，以与每个行为时期的中位持续时间相对应。每个时期的脉冲数量得以保留。我们定义了接近时期（进入气味端口前 500 毫秒）、等待时期（300 毫秒的奖励延迟，从进入水端口到开始获得水奖励）和饮水时期（开始获得水奖励后 1000 毫秒）。这些时期不适用于转换，因为它们的持续时间在试验中没有变化。以这种方式，常规光栅图被转换为事件对齐光栅图（图 2A和图 2 — 图补充 1B中的左图）。随后使用 20 毫秒的箱宽计算 EASH，并通过用光栅图中 60 毫秒宽的高斯滤波器卷积脉冲序列来平滑 EASH。

在气味引导的进食/不进食任务中，接近时期（从开始接近行为到接触盘子）的中位持续时间为 2.57 秒，进食时期（从开始进食到移除食物）的中位持续时间为 5.44 秒。每次试验每个时期的脉冲时间被线性转换为每个时期相应的中位持续时间。每个时期的脉冲数量被保留。我们定义了食物移除时期（开始移除食物后 2 秒），它不适用于此转换，因为这个时期的持续时间在各个试验中没有变化。因此，常规栅格图被转换为事件对齐栅格图（图 3B和图 3—图补充 2B中的左图）。随后使用 500 毫秒的箱宽计算 EASH，并通过将光栅图中的脉冲序列与 500 毫秒宽的高斯滤波器进行卷积来平滑。

️4.10 ROC 分析

为了量化放电率变化，我们使用了一种基于 ROC 分析的算法，该算法计算理想观察者对给定脉冲率是否在两种条件之一中记录的能力（例如在气味提示通过或不通过期间）。我们定义了一个 auROC 等于 2（ROC 面积 - 0.5），测量范围从 -1 到 1，其中 -1 表示一种替代方案的最强可能值，一种表示另一种替代方案的最强可能值。

使用置换检验确定 ROC 分析的统计显著性。对于该检验，在将所有发放率随机分配到两组 (例如 go-cue 试验组和 no-go-cue 试验组) 中的任一组后重新计算 ROC 曲线。此过程重复大量次 (所有分析重复 500 次) 以获得值分布。然后计算超过实际值的随机值分数。基于此量化，计算每个细胞的 auROC 值以及滑动窗口中 go/no-go 或吃/不吃任务的时间过程 (对于 go/no-go 任务，每 20 毫秒开始一个重叠的 100 毫秒窗口，对于气味引导的吃/不吃任务，每 100 毫秒开始一个重叠的 500 毫秒窗口)。然后通过量化从基线的发放率变化来计算 go 或 no-go 试验期间的 auROC 值 (图 1D和2A )。对于进食试验，我们采用了类似的程序，即量化相对于基线的放电率变化（图 3B），对于去试验，我们采用了类似的程序，即量化相对于不去试验的放电率变化（图 5A）。对于所有分析，均以 α = 0.01 进行显著性检验。这些分析仅包括每个分析条件下至少进行了 10 次试验的细胞。

️4.11 评估特定行为的神经调节

为了确定每个 vTT 细胞放电率增加最多的时间点以及任务期间放电率增加的持续时间，根据每个 auROC 值计算出两个测量值（图 2-图补充 3）：

调谐峰值时间：当一个细胞连续五个或更多个时间段的放电率从基线显著增加时，对应于显著点峰值的时间（p<0.01，排列检验）

调谐持续时间：包括调谐峰值时间在内的持续时间，其中增加的触发是显著的（p<0.01，排列检验）

在气味引导的 go/no-go 任务中，我们根据在正确的 go 试验中出现调谐高峰时间的时期，将具有调谐高峰时间的 vTT 细胞（n = 217 个细胞）分为五组。其中，7% 的细胞在接近时期出现调谐高峰时间，24% 在气味采样时期出现调谐高峰时间，23% 在移动时期出现调谐高峰时间，11% 在等待时期出现调谐高峰时间，15% 在饮水时期出现调谐高峰时间。

在气味引导的进食/不进食任务中，我们根据进食试验中调谐高峰时间出现的时期，将具有调谐高峰时间的 vTT 细胞（n = 192 个细胞）分为三组。总体而言，19% 的细胞在接近时期具有调谐高峰时间，20% 在进食时期具有调谐高峰时间，12% 在食物移除时期具有调谐高峰时间。

️4.12 重要反应的相对分布

每种细胞类型（图 2B和3C中的黄色和蓝色阴影）的行为时期特异性放电分布计算如下（图 2-图补充 4）。首先，对于每个细胞组，计算每个任务在每个时间段内具有显著兴奋性（或抑制性）放电的细胞数量。通过 MATLAB 中的 fitdist 函数使用高斯核平滑估计它们的分布，在气味引导的 go/no-go 任务中带宽为 100 毫秒，在气味引导的进食/不进食任务中带宽为 500 毫秒。其次，将显著兴奋性（或抑制性）放电的分布与每个细胞组的细胞混洗数据进行比较。为了计算该分布的 99% 置信区间，我们进行了 1000 次迭代，其中细胞组身份是随机的。然后，我们计算每个细胞组的显著兴奋性（或抑制性）放电的分布，如上所述。对于任务中的每个箱子，置信区间的边缘位于分布的 0.5 和 99.5 百分位数，这是根据细胞改组数据计算得出的（图 2-图补充 4C 中的灰色阴影区域）。通过将数据的标准差与从细胞改组数据中获得的标准差进行比较，可以确定每个细胞组活动模式的重要性，其中通过随机选择细胞进行 1000 次改组。

️4.13 SVM 解码分析

使用以线性核为分类器的支持向量机 (SVM) 算法和 Matlab 函数 (fitcsvm) 进行分析。所有分析均基于跨动物汇集的试验数据进行。包含每次试验和每个细胞的连接发放率的矩阵是分类器的输入。矩阵维数为细胞数乘以试验数。为了避免过度拟合，使用 k 倍交叉验证 (k = 10) 来计算试验类型辨别的解码准确度。为了计算解码准确度，选择每种试验类型的 40 次试验（从会话开始）作为数据集。接下来，将数据集分成 10 个相等的部分；一部分用于测试，剩余部分用于训练分类器。重复此过程 10 次以测试每个单独的部分。然后将准确度的平均值用于解码准确度。为了计算 100 毫秒箱窗口（步长：20 毫秒）的解码准确度，分类器使用 100 毫秒箱窗口（步长：20 毫秒）进行训练和测试。为了验证计算出的准确度的统计显著性，我们使用从数据集中随机选择的 1000 次重复来估计标签打乱数据的准确度分布。

️4.14 统计分析

数据在 Matlab 2019a 中分析。每个分析的统计方法如上所述、在结果部分或图例中描述。采用 Tukey-Kramer 方法进行具有多重比较的显著性检验。虽然本研究中的样本量不是通过样本量计算预先确定的，但它们基于嗅觉皮层领域的先前研究。未采用随机化和盲法。表 1和表 3显示了目标导向任务的生物和技术重复。图例中描述了组织学研究的生物重复。

️4.15 组织学

记录后，小鼠腹膜内注射戊巴比妥钠深度麻醉。使用四个四极电极导线之一，通过 10-20 μA 直流电刺激 5 秒来诱发电损伤。小鼠经心脏灌注磷酸盐缓冲液 (PBS)，然后用 4% 多聚甲醛 (PFA) 灌注。将大脑从颅骨中取出，后固定在 PFA 中。将大脑切成 50 μm 厚的冠状切片。首先通过追踪 DiI 的荧光来评估电极轨迹。用甲酚紫染色后，参考研究人员开发的小鼠大脑图谱确定电极轨迹和记录位置。

️4.16 原位杂交

使用成年雄性小鼠（n = 3）。根据制造商的方案，使用体外转录试剂盒生成地高辛 (DIG) 标记的Slc17a7和Gad1/2 RNA 探针，质粒由 Katsuhiko Ono 博士和 Yuchio Yanagawa 博士慷慨提供。用画笔将脑切片（20 μm 厚）安装在玻璃载玻片上，并在真空干燥器中干燥过夜。然后将干燥切片固定在 4% PFA 中，用蛋白酶 K（10 μg/mL）消化 30 分钟，并在 4% PFA 中后固定。预杂交后，将切片与 DIG 标记的 RNA 探针在 65°C 下孵育过夜。严格清洗后，用 1% 封闭试剂在 TNT 中封闭切片 1 小时。随后，将切片与碱性磷酸酶偶联的抗 DIG 抗体（1:1,000；）在 4°C 下孵育过夜。然后在 TNT 中清洗切片三次，在 TS 8.0（0.1 M Tris-HCl，pH 8.0，0.1 M NaCl，50 mM MgCl 2）中清洗一次。最后，根据制造商的说明，使用 HNPP 荧光检测套件检测碱性磷酸酶活性。孵育三次 30 分钟后，用 PBS 清洗切片。最后，将切片用 NeuroTrace 绿复染，并安装在 PermaFluor中。

️4.17 逆行追踪

成年雄性小鼠用美托咪啶（0.75 mg/kg ip）、咪达唑仑（4.0 mg/kg ip）和布托啡诺（5.0 mg/kg ip）麻醉，然后放入立体定位仪。使用注射泵进行注射，该注射泵连接到 Hamilton 注射器，并使用安装好的尖端直径为 50 μm 的玻璃微量移液器通过适配器连接到注射器。

将与 Alexa 555结合的 CTB 单侧或双侧注射 (300 nL，100 nL/min) 到 mPFC (A/P，2.4 mm；M/L，距 bregma 0.4 mm；D/V，距脑表面 1.0 mm；n = 3 来自两只小鼠)、OB (A/P，4.3 mm；M/L，距 bregma 0.8 mm；D/V，距脑表面 1.5 mm；n = 3 来自两只小鼠)、AON (A/P，2.8 mm；M/L，距 bregma 1.3 mm；D/V，距脑表面 2.6 mm；n = 3 来自两只小鼠)、OT (A/P，1.5 mm；M/L，距 bregma 1.0 mm；D/V，距脑表面 4.7 mm；n = 5 来自三只小鼠）、APC（A/P，2.3 mm；M/L，距前囟 1.8 mm；D/V，距大脑表面 3.4 mm；n = 4 来自四只小鼠）或PPC（A/P，-1.5 mm；M/L，距前囟 3.6 mm；D/V，距大脑表面 4.5 mm；n = 3 来自两只小鼠）或vTT（250 nL；A/P，0.3 mm 倾斜 30°；M/L，距前囟 0.4 mm；D/V，距大脑表面 4.6 mm；n = 3 来自两只小鼠）。手术后，小鼠接受阿替美唑（0.75 mg/kg ip）和酮洛芬（5 mg/kg，ip）。一周后，小鼠深度麻醉，并用生理盐水灌注，然后在麻醉下灌注 4％PFA。将大脑切成50μm厚的冠状切片。

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