Open Ephys电生理系统用于体外神经药理学测试的紧凑型256通道多孔微电极阵列系统

微电极阵列（MEAs）已被广泛用于利用嵌入平面玻璃基底的多个电极测量培养神经元的细胞外锋电位活动。它已被用于通过检测自发网络活动所反映的药理扰动来研究药物效应。通过在微电极阵列中设置多个孔，高通量电生理检测得以实现，从而加快了药物测试速度。尽管在获取大量电生理数据方面有其优点，但商业多孔微电极阵列系统成本高、体积大，最重要的是缺乏可定制性，这使得潜在用户无法在药物实验中充分使用该系统。在这项工作中，我们通过将定制的紧凑型256通道多孔微电极阵列集成到标准显微镜载玻片上，并结合基于商业专用集成电路（ASIC）芯片的记录系统，开发了一个基于微电极阵列的药物测试平台。我们在16个孔中设置了256个电极，以最大限度地从单个芯片收集数据。与先前报道的多孔微电极阵列相比，本工作中的多孔微电极阵列设计更加紧凑，芯片尺寸更小。将四种突触调节剂（N - 甲基 - D - 天冬氨酸（NMDA）、α - 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）、荷包牡丹碱（BIC）和三磷酸腺苷（ATP））应用于多孔微电极阵列，并分析神经锋电位活动，以研究它们对培养神经元的神经生理效应。通过利用市售的数字放大器芯片并定制用户偏好的模拟前端接口设计，在减小平台尺寸和成本方面具有额外优势，分析各种神经药理学化合物变得更加容易。

️ 一、介绍

微电极阵列（MEA）是一种嵌入基底的微小电极阵列，能够并行测量电活性组织的细胞外锋电位。1,2由于其具有多位点、非侵入性和长期测量能力，微电极阵列被广泛用作一种神经生理学工具，用于研究同步网络活动的动力学、3,4信号转导5 - 7以及阿尔茨海默病、癫痫和肌萎缩侧索硬化（ALS）等疾病模型中的网络活动发展。8 - 10此外，微电极阵列被用作一种药物检测工具，能够在用药后探测受扰的网络活动，从而确定神经生理学效应。自从将微电极阵列芯片上培养的神经元用作基于细胞的生物传感器以来，11已经将各种类型的药物应用于源自皮层、海马体和脊髓的培养神经元，以研究神经生理学药物效应。目前，非常需要快速且稳健的临床前筛选策略来研究针对突触受体的神经精神类化合物。12需要足够的测试样本以收集大量数据点、减少批次间差异并得出可靠且具有预测性的结果。然而，制备大量芯片是一项劳动密集型任务，且芯片间差异较大。

为了缓解这些问题，应该通过增加单个芯片上的孔数（例如多孔微电极阵列）来实现并行筛选平台。高通量多孔微电极阵列是必不可少的，并且已被视为一种收集大量数据点的有效药物筛选工具。13已经开展了一些工作来开发采用多孔板规格的内部高通量多孔微电极阵列。已开发出分布在3×3孔阵列14以及96孔和384孔微电极阵列15,16中的叉指电极（IDE），以通过监测阻抗变化来定量研究药物的功效。还展示了用于神经生理学记录目的、每孔有8个孔且每孔有32个微电极的多孔微电极阵列原型。17最近，有多家供应商（a） - （d）提供用于神经生理学研究的多孔微电极阵列，这些阵列有数百个电极，被分成12、24、48和96个孔。尽管多孔微电极阵列现在已经在市场上有售，但仍然迫切需要开发小型化且孔数更多的微电极阵列，以用于高通量药物测试。微电极阵列的制造研究主要集中在电极设计、18 - 23电极材料24,25和空间密集电极阵列26上，而没有积极地致力于开发多孔型微电极阵列本身。

在定制过程中，需要简单而紧凑的多孔微电极阵列设计，以便在给定尺寸的基底中高效分配大量电极和孔，同时不损害生物功能。通过定制系统，可以在电极大小、排列以及芯片尺寸方面高度自由地设计微电极阵列，而不受模拟前端接口的任何限制。例如，可以在微电极阵列中采用与大多数生物测定设备兼容的标准载玻片尺寸。此外，为了进一步与创新研究技术（例如微流体技术）集成，获得完全可定制的微电极阵列系统是必不可少的。这是因为商业产品通常针对其原始外形规格进行优化，对其他仪器系统的修改或兼容性有限。

为了充分利用高通量多孔微电极阵列设计的优势，我们需要开发一个与定制的微电极阵列无缝兼容的大规模数据采集系统。记录系统必须允许我们同时访问所有记录通道。随着通道数量的显著增加，主要挑战是开发有效的数据处理策略，以尽量减少不断增加的引出线数量和采集系统的物理尺寸。最近，用于电生理学的商用专用集成电路（ASIC）数字芯片已经容易获取。（e）这种能够同时记录多通道模拟信号（每个芯片多达64个通道）且具有完全数字化输出（片上多路复用和模数转换）的小型化芯片，可以有效地取代庞大的多通道记录系统。目前，基于64通道ASIC芯片的数据采集可以轻松扩展到1024通道。27因此，它被视为构建和定制多孔型微电极阵列系统的一种有前途的使能技术。虽然神经技术领域的近期研究积极利用了ASIC芯片，但大多数工作集中在体内实验（脑电图、脑皮层电图等）27 - 30上，在利用其优势构建体外神经记录系统方面（限于16个通道或缺乏内置模数转换器）还没有足够的努力。31 - 33对于使用ASIC芯片的体外大规模记录系统，开发简单但可靠的与多孔微电极阵列芯片接口的方法势在必行。

在此，我们报道一种紧凑的多孔微电极阵列，它带有基于商用ASIC的体外高通量记录系统，用于研究电生理药物反应。我们制造了一种16孔设计、256通道的微电极阵列，其尺寸为标准载玻片大小，在先前报道的多孔微电极阵列中实现了最紧凑的设计。所有从电极连接到连接焊盘以便将信号中继到外部读出系统的导线都在玻璃芯片上制造，无需印刷电路板（PCB）连接适配器（这是一种成本效益高的方法），从而减轻了焊接多个芯片的劳动强度，并消除了对PCB涂层、焊接或密封结合可能产生的毒性效应的担忧。通过与导电聚合物（聚（3,4 - 乙烯二氧噻吩）聚苯乙烯磺酸盐，PEDOT:PSS）进行电聚合，对每个电极进行修饰以提供低噪声记录。基于ASIC芯片的微电极阵列 - 数据采集系统接口模块用于实现高记录产量。将分离的海马神经元培养在16个孔中，并测量每个孔的网络峰电位，以验证多孔微电极阵列和读出系统的记录性能。最后，作为神经化学测试的演示，使用培养的海马神经元评估了突触相关化学物质（N - 甲基 - D - 天冬氨酸（NMDA）、α - 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）、荷包牡丹碱（BIC）和三磷酸腺苷（ATP））对神经生理活动的影响。

️ 二、材料和方法

️2.1 微电极阵列的制造

光刻与金属沉积：使用负性光刻胶（NR9-3000PY）在0.7毫米厚的8英寸玻璃晶圆上进行光刻，通过电子束蒸发沉积Ti/Au层（20/100纳米），然后进行金属剥离工艺，形成微电极、导线和接触垫的图案。

绝缘层沉积：使用等离子增强化学气相沉积（PECVD）在金属图案化的玻璃晶圆上沉积SiO2/Si3N4/SiO2绝缘层，厚度分别为100/150/100纳米。

电极开口：使用正性光刻胶（DOW SPR 700）进行光刻，通过干蚀刻（CHF3/Ar气体）蚀刻绝缘层，形成电极开口，开口尺寸比电极大10微米，以防止电极边缘在清洗和电化学沉积过程中出现裂纹和分层。

晶圆切割：清洗残留光刻胶后，将晶圆切割成显微镜载玻片尺寸（75毫米×25毫米），每个8英寸玻璃晶圆可生产10个多通道MEA。

️2.2 细胞培养室的制造

PDMS混合与成型：将50克未固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体与5克固化剂在真空室中预混合并脱气，然后倒入培养皿中，在60°C烤箱中固化6小时，形成PDMS平板。

打孔与组装：根据MEA的布局，在PDMS平板上打孔形成细胞培养室，将PDMS培养室和MEA玻片清洗后，在60°C烤箱中干燥，然后通过空气等离子体处理1分钟（30瓦），将两者不可逆地结合在一起，最后制作PDMS室盖以防止蒸发。

️2.3 PEDOT:PSS导电聚合物的电聚合

溶液制备：使用Gamry Ref 600恒电位仪进行电聚合。制备0.02M的EDOT（3,4-乙烯二氧噻吩）和0.01M的PSS（聚苯乙烯磺酸盐）溶液，然后混合得到PEDOT:PSS溶液。

电聚合过程：将每个微电极作为工作电极，16个共面接地垫（每个6.3平方毫米，总面积100.8平方毫米）作为参比/对电极，通过定制的带有256个弹簧针的适配器印刷电路板（PCB）将MEA与恒电位仪连接。所有256个电极短路并同时施加恒定电压进行电聚合，在不同电极尺寸下施加不同时间的+1.2V电压，最后在10Hz至100kHz频率范围内施加10mV交流电压测量交流阻抗。

️2.4 基于ASIC的体外256通道记录系统

芯片与组件采购：购买8个32通道低噪声放大器芯片（RHD2132，Intan Technologies），其具有数字输出，可在两个连续阶段放大模拟神经信号（增益分别为96和2），滤波带宽数字可调（最低截止频率0.1Hz，最高截止频率20kHz），放大后的模拟信号在芯片上进行32:1多路复用和数字化（最大采样率30kHz，16位分辨率）。其他离散组件从不同供应商采购，大部分采用自开源电生理系统Open Ephys。

️东莞富临医疗科技有限公司是Open Ephys 和 Intan Technologies 在亚洲的代理商，富临医疗为亚洲客户提供“技术服务”与“电生理产品”

印刷电路板设计与制造：使用Eagle软件设计多个PCB，放大器板从Intan Technologies的公开设计文件修改而来，256通道采集板从Open Ephys的公开设计简化修改而来。使用弹簧针连接PCB适配器和MEA芯片，标准0.1英寸引脚连接用于放大器板与PCB适配器的集成，使用丙烯酸支架固定MEA玻片，FPGA采集板安装在商业铝制外壳中，并进行电缆连接开口改造。

️2.5 细胞培养

培养基准备：使用培养基补充B27、2 mM GlutaMAX-1和1%青霉素-链霉素作为培养维持培养基，添加12.5 μM L-谷氨酸的培养基作为接种培养基。

细胞处理与接种：将MEA基底用0.1 mg/ml聚-D-赖氨酸在空气等离子体处理后涂层1小时，从E18 Sprague-Dawley大鼠胚胎中提取海马组织，在Hank’s平衡盐溶液中机械研磨，离心后去除上清液，加入接种培养基进一步研磨，通过尼龙细胞筛过滤收集分离的神经元，以约1000个细胞/平方毫米的密度接种在多通道MEA的每个孔的基底上，最后在37°C、5% CO2的湿润环境中培养，每周更换两次50 μL的培养基。

️2.6 MEA记录与数据分析

记录设置：使用Open Ephys软件控制数据采集系统，将放大器板放置在设定为37°C、5% CO2的干燥培养箱中，在12至17天体外培养（DIV）期间进行记录，覆盖薄PDMS膜以防止培养基蒸发。

数据处理与分析：将RHD2132放大器的带宽和采样频率分别设置为150 - 5500 Hz和25 kHz，记录数字化连续数据流后离线分析，使用自定义MATLAB代码提取信号超过背景噪声标准差6倍的峰电位。对于后分析，使用基线平均峰电位发放率超过0.1个/秒的活动通道，计算网络范围内的峰电位发放率（AWSR），并在10分钟记录中计算平均AWSR并归一化以评估药物对网络兴奋性的影响，还计算爆发性指数，使用Neuroexplorer分析活动通道中的爆发，确定爆发检测的最小惊喜水平，评估平均爆发率（MBR）、平均爆发持续时间（MBD）、平均爆发间隔（MIBI）、平均爆发频率（MFB）和爆发中峰电位百分比（PSB）等指标，最后计算每个活动通道的速率直方图（bin: 10 ms）的皮尔逊相关系数（CC）。

️ 三、结果

️3.1 紧凑型多孔微电极阵列（MEA）的设计与制造

多孔MEA是为体外药物筛选而设计的，通过记录和分析药物处理后的细胞外神经活动（图1a）。我们使用微加工工艺在每片晶圆上生产了总共十个MEA芯片（图1b）。为了设计256通道多孔MEA，考虑了电极和孔区域在玻璃载玻片上的紧凑排列（图1c）。包含16个孔（2×8，直径6毫米），每个孔内有16个电极，以4×4的排列方式排列，电极间距为200微米，电极尺寸为10、30或50微米。一个面积为6.3平方毫米的大平面金电极位于记录区域外，作为接地电极。每个孔中的接地电极共享相同的外部接触垫。总共256个接触垫（0.8毫米见方，1毫米间距）分布在玻璃载玻片MEA的上下边缘，使用弹簧针将信号从芯片传递到放大板。图2a展示了完成的256通道多孔MEA芯片和PEDOT:PSS修饰的电极。多孔细胞培养室被设计为提供高质量的显微镜成像、流体隔离和健康的细胞培养条件。如果孔的直径小于6毫米，由于壁处明显的弯月面效应，细胞成像将变得困难。孔之间的间距被确定为3毫米，以实现物理稳定性和PDMS室与MEA芯片表面之间的无泄漏密封。室的高度为7毫米，以容纳至少100微升的培养基。每行孔的中心间距为9毫米，这是从标准多吸头间隔中采用的，便于使用8通道电子吸头进行MEA表面涂层、细胞播种、培养基交换和药物处理。为了在如此小的培养基体积中维持健康的神经细胞培养，安装了一层薄PDMS膜，该膜能够实现可逆的、贴合的密封，并紧密地密封在多孔PDMS室的表面上。我们确认了我们的PDMS膜-室组件具有高质量的防水性（在干燥的二氧化碳培养箱中24小时内体积损失小于10%，而没有PDMS膜的内部则为40%）和二氧化碳气体的渗透性（图S1）。

图1. 紧凑型多孔MEA的设计原理图a：使用微电极阵列进行基于神经元的药物筛选的概述。b：MEA的微加工工艺。使用光刻和剥离工艺进行金属图案化和垫片，通过干法蚀刻打开电极。原位电沉积PEDOT:PSS。c：256通道多孔MEA的示意图。在标准载玻片中集成了16个MEA，每个MEA包含4×4的电极阵列。使用弹簧引脚接口将信号传递到记录硬件。PDMS室和膜分别作为多孔细胞培养室和防止蒸发的盖子。每个单元孔MEA作为一个基于神经元的传感器，通过捕获受扰动的神经活动，适用于多种药物测试。尺寸未按比例。

图2. PEDOT:PSS微电极的制造和特性a：带有PDMS室和膜集成的显微镜载玻片上的256通道和16孔MEA。在单位孔中电沉积的16个微电极阵列以及PEDOT:PSS沉积电极的放大扫描电子显微镜图像。b：在256个电极上进行恒电位PEDOT:PSS电沉积时测量的电流。c：三种不同尺寸的电沉积PEDOT:PSS微电极的阻抗幅度分布。插图显示了30微米和50微米PEDOT:PSS电极的分布。d：电沉积后根据电极尺寸的阻抗幅度和e：相位变化（n=32个裸电极（之前），256个PEDOT:PSS电极（之后），每个电极尺寸的均值±标准差）。

️3.2 PEDOT:PSS修饰的多孔MEA的特性

为了测量培养神经元的小生物电信号并提高检测灵敏度，降低电极-电解质界面阻抗是有效减少电极热噪声的方法。在本研究中，由于PEDOT:PSS导电聚合物不仅具有良好的电导率，还具有生物相容性和长期的电稳定性，因此被选为电极涂层材料。与逐个电极进行电镀相比，这对于256通道MEA来说是不切实际的，电压控制的同时沉积显著降低了仪器的复杂性和电镀时间。电极沉积过程中的电流注入的可重复性也得到了确认（图S2）。成功沉积的PEDOT:PSS电极阵列在孔中显示出绿色或蓝色，填充了整个电极区域（图2a）。我们观察到沉积的PEDOT:PSS电极表面粗糙。每个电极的平均电荷传递量，即计时电流曲线下的面积（图2b）除以256（使用的电极数量），分别为10、30和50微米电极的130纳库仑、660纳库仑和1400纳库仑。256个PEDOT:PSS电极在1千赫兹（神经尖峰信号的中心频率）的阻抗幅度的狭窄分布表明，我们可以精确控制30和50微米电极的阻抗幅度低于30千欧（图2c）。256个电极的阻抗幅度显示出非常小的变异系数，分别为30微米和50微米电极的0.05和0.03，而10微米电极为0.38。10、30和50微米电极的阻抗幅度分别从5.2兆欧、3.0兆欧和1.4兆欧降至105千欧、19千欧和10千欧（图2d）。所有尺寸的相位值从接近-90度变为小于-30度，这表明电极界面变得更加电阻性，主要是由于PEDOT:PSS电沉积后表面积增加（图2e）。

️3.3 基于ASIC的256通道体外MEA读出系统

256通道体外神经记录系统主要由五个模块组成：（1）前文所述的256通道多孔PEDOT:PSS MEA，（2）MEA芯片安装系统，（3）四个64通道放大板，（4）数字化记录数据采集板，以及（5）用于数据存储和分析的PC（图3a）。我们发现，连接产量和性能（例如噪声和重复性）对于开发一个可靠、功能齐全的高通道数记录系统确实至关重要。此外，为了简化和降低成本，需要去除体外神经记录中不必要的组件。因此，我们从头开始开发每个模块，或者从现有的ASIC芯片系统的开源蓝图中进行修改，这些系统是为体内电生理实验而特别设计的。

图3. 256通道体外MEA读出系统a：256通道多孔MEA和基于数字ASIC芯片的体外神经记录系统的系统组织框图。b：基于数字ASIC芯片的256通道体外多孔MEA记录系统。数字化数据采集板（顶部，M4）通过微型HDMI电缆连接到四个64通道放大板（中间，M3）。测试并比较了各种数字数据电缆。（比例尺表示10毫米）。描述了用于模块间接口的两种引脚连接器（弹簧引脚和0.1英寸引脚连接器，分别为C1和C2）。（底部）。未显示USB连接和PC。请参阅补充信息。（c）使用（b）中描述的各种数字化输出信号电缆的256通道记录系统的输入参考噪声。（均值+标准差，n=64个电极）。256通道MEA中的所有电极均接地进行测试。对于每种电缆样本，测试了64个电极并取平均值。

MEA芯片安装系统使用一个带有适配器PCB的凹形亚克力MEA外壳（或支架），通过256个弹簧针可靠地接触MEA上的256个外金属接触垫，并连接到256通道放大板（图3b）。在不丢失连接的情况下接触所有256个通道垫需要优化外壳深度、MEA载玻片芯片厚度和弹簧针高度的设计，以便始终在针上保持一定的压力，以实现低电阻的电气接触。我们以百微米的分辨率优化了亚克力外壳的深度，以适应MEA的厚度，使弹簧针能够被充分按压以实现可靠的电气连接。为了将放大板牢固地集成到适配器板上，使用了标准的0.1英寸针连接器。基于ASIC的64通道放大板是通过对商业上可获得的32单极输入放大板（部件号C3314）和电极适配器板（部件号C3410）进行修改设计的。通过去除不必要的连接器，我们在一个PCB上集成了两个32通道ASIC芯片，从而实现了如图3b中M3所示的简化放大板。新制造的64通道放大板的性能被发现在下一节中与商业上可获得的一致。为了将数字化记录数据采集到PC，基于FPGA的采集板是通过对开源采集板进行修改设计的。我们使用FPGA模块制造了两个版本的采集板：一个具有通过BNC连接器的两个通道模拟外部输入和输出（图S6a），另一个仅具有256通道记录功能（图3b中的M4）。设计中的关键区别是将原始设计中的256通道数字数据SPI电缆和连接器替换为更流行的现成数字电缆（HDMI，高清晰度多媒体接口）。

配置定制体外系统的一个考虑因素是选择用于传输数字化信号的电缆。SPI电缆具有柔韧且薄的优点，适用于从自由活动动物记录大脑信号。然而，我们得出结论，它对于体外硬件来说并不是必要的，而且它相当昂贵且专有。作为原始连接选项的更便宜且更通用的替代品，我们测试了各种类型（A型和D型）的标准HDMI电缆。这些电缆的成本仅为原始SPI电缆的一小部分（不到3%），并且是为可靠的数字数据传输而特别设计的，甚至可以处理比原始12数据针连接更多的数据（19针）。

为了验证所开发系统的性能，我们将所有放大器输入通道接地后测量并比较了系统噪声。在SPI、标准HDMI（A型）和微型HDMI（D型）电缆之间，均方根（RMS）噪声值没有显著差异（图3c）。所有电缆选择的输入参考RMS噪声值均低于3微伏，与ASIC芯片的输入噪声规格（2.4微伏）相当。在不同类型的HDMI电缆选项中，我们发现微型HDMI由于尺寸小、机械刚性低且插入力小而更有优势，同时没有显示出噪声退化的迹象。还需要注意的是，我们的256个电极中没有任何一个在弹簧针接口处出现连接问题。由于整个多孔MEA系统的物理尺寸较小（12厘米×16厘米）和数字输出电缆数量较少（四根微型HDMI电缆），我们可以将我们的256通道记录系统放置在一个小型培养箱（408（W）×482（D）×550（H）毫米尺寸）内（图S6b）。对于长期记录，记录产生的热量不会影响培养基的温度。在室温下，ASIC芯片的表面温度在连续运行30分钟后比PCB背景升高了3摄氏度（图S6c）。在培养箱内相同条件下，细胞培养液的温度变化可以忽略不计（37.1摄氏度~37.3摄氏度，图S6d）。

️3.4 从培养神经元记录尖峰

接下来，测试了从256个通道读出系统的神经尖峰记录能力。随着神经元的生长和成熟，神经纤维覆盖了基底的大部分背景，形成了网络（图4a）。在培养2周后记录了神经尖峰，并通过1微摩尔TTX（电压门控钠通道阻断剂）处理来测试检测到的尖峰的生物起源，这消除了构成爆发的尖峰，并证实检测到的尖峰主要来源于附近神经元实体的动作电位（图4b）。图4c显示了从16个孔、256个电极成功记录的自发神经尖峰。每个孔中的尖峰活动显示出典型的同步爆发，这些爆发以持续数百毫秒到几秒的网络范围内的尖峰活动为特征。然后，我们以孔为单位对感测质量进行了表征，以测量尖峰的峰-谷电压和活动通道的数量。这两个参数在孔之间没有显著差异（图4d）。测量的尖峰峰-谷电压范围从大约20微伏到600微伏，中值约为40~60微伏。大部分电极参与了整个孔中的神经尖峰感测。一些电极测量到具有不同幅度的复杂尖峰信号。为了量化每个电极测量到的尖峰，根据峰-谷电压将尖峰分类为小（19~50微伏）、中（50~100微伏）和大（>100微伏）。能够检测到的最小尖峰为19微伏，而最大尖峰达到573微伏。在测量的尖峰中，44.9%被分类为小，40.4%为中，14.7%为大（图4e）。最后，为了验证每个孔中的神经活动彼此之间功能隔离且没有交叉干扰，使用尖峰率直方图（时间间隔：10毫秒）计算了成对相关系数（CC）。正如每个孔在尖峰图中显示出独立的同步爆发模式（图4c）一样，预期每个孔内的相关性较高。同一网络内的平均CC值为0.25（CC值范围从0.11到0.41），而不同网络之间的CC值则不显著（图4f）。

图4. 从多孔MEA记录细胞外尖峰a：海马神经元在3天和15天时的显微照片（左侧和右侧）。b：12天时TTX处理前后的细胞外尖峰记录。TTX处理前检测到的尖峰波形叠加显示在底部（比例尺：1毫秒）。c：来自孔#2的原始细胞外信号，显示典型的全网络爆发和爆发内的全阵列尖峰（红色虚线框区域）。右侧，来自16个孔、256个通道的10分钟自发尖峰活动以尖峰图形式呈现。每一行代表一个电极通道的尖峰时间戳，16个连续通道来自同一个孔。d：测量的峰-谷尖峰幅度和16个孔（50微米电极）中活跃通道数量的须（最小到最大）和箱（25%到75%百分位）图。e：将尖峰幅度分类为小（~50微伏）、中（50-100微伏）和大（100-500微伏）。f：显示孔间和孔内尖峰活动（10毫秒分箱率直方图）的平均相关系数的须（最小到最大）和箱（25%到75%百分位）图（学生t检验；p值p<0.05为统计显著，***p<0.001，n=120对孔，n=16孔分别用于孔间和孔内条件）。

️3.5 基于多孔MEA的药物筛选测试

实现高质量和可重复的药物测试结果至关重要。在这里，我们展示了通过我们的多孔平台进行相对大量的样本的药物测试是可行的，这对于统计功效至关重要。在第一个演示部分，我们通过应用调节兴奋性或抑制性突触的化学物质（NMDA、AMPA、BIC）并量化网络范围内的尖峰率来评估多孔MEA平台的药物筛选性能，以重现之前的药物反应结果。接下来，我们研究了ATP的神经调节作用。ATP是从星形胶质细胞释放的细胞外信号分子，已知在调节神经元兴奋性方面发挥关键作用。

药物测试协议如下：基线活动（10分钟），载体条件（10分钟），药物应用（20分钟）。从低到高浓度逐步添加化学物质，并在每个浓度阶段稳定10分钟并记录10分钟。NMDA、AMPA和BIC的浓度范围是参考其他文献确定的。为了增加统计功效，我们对每种药物至少测试了10个网络样本（NMDA为11个，AMPA为22个，BIC为22个，分别使用2、2和3个多孔MEA芯片）。在其他研究中，使用多孔MEA评估化学物质对神经生理活动的影响时，使用了9到30个网络样本，我们认为这些数字是合理的。

网络范围内的尖峰率（AWSR），即网络中所有活动通道的平均尖峰率，被分析以衡量整体网络尖峰活动的程度。与基线AWSR标准化后，载体条件（n = 79孔）显示出平均146%的值，标准差为52%，25%到75%的百分位数为113%到167%（图S3）。任何偏离±1倍标准差的孔在后续分析中被排除。

三种化合物的测量尖峰率反应与参考测定结果一致。在NMDA处理后，AWSR出现了三种不同的反应。在0到1.1微摩尔的低浓度下，没有显著变化。随着浓度的增加，反应增加，并在8.1微摩尔时达到峰值，与基线相比（图5b）。进一步将NMDA浓度从8.1微摩尔增加到38.1微摩尔，显示出在38.1微摩尔时下降了-75%的变化，IC50值为20.1微摩尔。峰值反应浓度（Cmax）和IC50值与其他研究（Cmax：10微摩尔，IC50：24.5微摩尔）非常吻合。在AMPA处理的情况下，尖峰率从0微摩尔增加到0.31微摩尔，然后在0.31微摩尔以上下降（图5c），这与之前的报告一致。在BIC处理的情况下，尖峰率响应在0到100微摩尔的浓度范围内呈对数线性增加（图5d），这与文献一致。

图5. NMDA、AMPA、BIC和ATP应用后的神经生理活动特性a：NMDA、AMPA、BIC和ATP处理后，来自一个网络样本的浓度依赖性全阵列尖峰率（AWSR）。b-e：随着NMDA、AMPA、BIC和ATP浓度增加，平均网络尖峰率的变化。f：最终浓度为0.1、1.1、11.1、111.1、1111.1微摩尔的ATP处理，以及来自一个活跃通道的分段尖峰图（100秒）。尖峰图上方的红星表示爆发检测时间点。g：根据应用的ATP浓度，全阵列尖峰活动的爆发指数。h：平均爆发率（MBR）的变化，i：平均爆发持续时间（MBD），j：平均爆发间隔（MIBI），k：爆发中的平均放电率（MFB），l：随着ATP浓度增加，爆发中的尖峰百分比（PSB）。m：在0.1、1.1、11.1、111.1、1111.1微摩尔ATP浓度下，来自一个网络样本的相关矩阵。矩阵中的每一行和每一列代表一个活跃通道。n：在不同ATP浓度下，矩阵中的平均相关系数（CC）值（Hill方程拟合，R平方为0.36）。除非另有说明，事后比较测试仅与载体条件（0微摩尔）进行比较，以显示显著差异。（均值±标准误，AWSR、爆发分析和CC的一元方差分析，事后Dunnett多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，AWSR n=11、22、22、20孔，分别来自2、2、3、3个多孔MEA芯片，爆发指数（n=20孔，3个多孔芯片），MBR（n=17孔，3个多孔芯片），MBD、MIBI、MFB和PSB（n=17、17、10、10孔，分别用于0、0.1、1.1和11.1微摩尔ATP，3个多孔MEA芯片），CC（n=14孔，3个多孔MEA芯片））。

NMDA和AMPA是NMDA和AMPA受体的激动剂，这些受体是兴奋性神经递质谷氨酸的突触后离子型受体。激动剂的处理预计将增加神经元的兴奋性，但在高剂量下它们会变得兴奋毒性。在我们的反应曲线上，增加的兴奋性由AWSR的增加表示，而AWSR在高浓度下的下降则表示神经毒性效应。与AMPA反应曲线不同，NMDA曲线在低浓度下有一个平台区域，没有显示出显著的AWSR变化。两种受体激活机制的差异可能导致了反应的差异，其中NMDA受体的激活需要强烈的去极化和足够的谷氨酸释放。BIC是GABAA受体的拮抗剂，用于抑制性神经递质GABA。BIC的处理预计将阻断抑制性神经传递并解除神经元的抑制，这在BIC反应曲线的AWSR增加中得到了反映。

最后，我们尝试测试ATP的效果，已知ATP调节神经网络活动，但从未使用MEA芯片进行过测试。ATP的外源处理浓度范围为0.1微摩尔到1000微摩尔。我们使用了三个多孔MEA，总共20个孔样本。尖峰率分析显示，在剂量依赖的ATP处理下，整体尖峰率没有显著变化（图5e）。我们推测尖峰率指标可能无法完全捕捉到网络水平上的ATP调节效应。因此，通过测量爆发模式来量化网络爆发模式，这是培养神经网络的新兴特性。图5f显示了带有检测到的爆发的尖峰图。视觉检查表明，在超过10微摩尔的浓度下，爆发数量突然减少。为了量化爆发的显著变化，我们分析了爆发参数，包括爆发指数、爆发率、爆发持续时间、爆发间隔、爆发中的放电率和爆发中的尖峰百分比。爆发指数，用于量化尖峰的时间聚集和爆发程度，在超过1.1微摩尔的浓度下减少（图5g）。平均爆发率在0.1微摩尔时增加了137%，但在1.1微摩尔时相比基线条件减少了47%（图5h）。进一步将ATP浓度增加到11.1微摩尔，导致显著减少-79%。平均爆发持续时间似乎随着浓度的增加而增加，但由于均值的标准误差太大，没有观察到显著差异（图5i）。爆发间隔在11.1微摩尔时增加了150%（图5j，p<0.05）。爆发中的平均放电率在1.1微摩尔和11.1微摩尔时分别显著减少了-31%和-51%（图5k）。爆发中的尖峰百分比在1.1微摩尔和11.1微摩尔时显著减少，分别为25%和27%，而载体条件下的百分比为47%（图5l）。最后，成对相关系数（CC），用于表示网络范围活动的时空尖峰模式或同步性的相似程度，被用作分析ATP对网络范围活动的时空尖峰模式或同步性的影响的指标。图5m显示了一个孔的CC。从颜色编码的矩阵中可以清楚地看到，随着应用的ATP浓度增加，整体CC值减少。平均CC值显示出典型的剂量-反应曲线（Hill方程，R平方：0.36）（图5n）。使相关系数减半的ATP浓度估计为0.9微摩尔。

️ 四、讨论

本研究的目标是开发一个能够在紧凑芯片上进行并行药物测试的多孔MEA系统。像其他生物芯片一样，用于体外药物筛选的预临床测试试剂盒在实验室规模的研究中经常用于快速方便地预筛选药物候选物并测试药物效果。正如试剂盒便于处理且可以通过简单的移液进行测试一样，我们希望通过紧凑设计的多孔MEA实现基于神经元芯片的并行药物测试。

减少多孔MEA尺寸的主要思路是尽量减少不必要的自由空间，并缩小足以维持培养活性的孔尺寸。电极阵列和孔阵列被高效地分布，以适应标准玻璃载玻片的紧凑尺寸，并使每个孔的容器体积为100微升。孔密度（孔数除以芯片面积）和紧凑因子（电极数除以芯片面积）在多孔MEA中排名很高（补充表中详细信息）。此外，采用25毫米×75毫米的显微镜载玻片格式作为多孔MEA的尺寸将有利于多种应用。例如，它允许方便地使用与载玻片相关的附件（例如载玻片支架、架子和染色皿）和培养室产品。微流控装置通常采用载玻片格式，也可以集成在多孔MEA上（通过替换PDMS培养室），以精确控制药物剂量，用于长期高通量药物筛选。它还可以应用于自动成像仪器，例如显微镜载玻片扫描仪，以进行细胞活性测定，这将证实电生理学结果。

低阻抗的电极修饰对于获得良好的信号质量至关重要。我们采用了恒电位（电压控制）沉积方法，在256个裸金电极上电聚合PEDOT:PSS以降低阻抗，并成功在256个电极上获得了可靠且均匀的涂层。电压控制模式有利于使用单个电压源对多个电极甚至不同尺寸的电极应用相同的沉积条件。10微米、30微米和50微米电极的阻抗幅度在1千赫兹时分别为105千欧、19千欧和10千欧，与其他使用PEDOT:PSS的MEA研究相当，这些研究显示25微米电极为27千欧，30微米电极为20千欧。与未修饰的电极相比，阻抗降低了两个数量级以上，整体均方根噪声水平为3.60微伏均方根（对于50微米电极），足以检测小至20微伏的尖峰。此外，电极阻抗比放大器输入阻抗（1千赫兹时为13兆欧，芯片数据表）低两个数量级，这对于最小化信号衰减至关重要。

将药物应用于多个孔并监测其网络活动，通过减少使用单孔MEA的实验步骤重复，提供了结果的统计功效和效率。我们能够展示研究ATP对培养海马神经元的调节作用。使用爆发和相关系数指标而不是尖峰率，可以清楚地观察到ATP的剂量依赖性效应。这是因为尖峰率只能描述神经元的平均活动水平，而爆发和相关系数指标涉及关于尖峰时间模式的信息。在之前的研究中，ATP通过激活抑制性神经元中的嘌呤能P2Y受体来减少锥体神经元的过度兴奋（0.1毫摩尔-1毫摩尔）。ATP可能以类似的方式作用，打破了兴奋性-抑制性平衡，从而减少了网络尖峰活动的相关性，并抑制了爆发活动，这反映在爆发指数、爆发率、爆发中的放电率和爆发中的尖峰百分比的减少上。

️ 五、结论

通过制造256个电极、16孔且尺寸为显微镜载玻片大小的微电极阵列（MEA）以用于高通量检测，开发出了紧凑且低成本的神经药理药物筛选系统。该系统能够在单个多通道MEA芯片上的培养神经网络中同时测试多达16种不同的药物剂量。除了在紧凑空间内具备高通量药物筛选能力之外，我们的显微镜载玻片MEA还能与商业显微镜仪器以及现有的生物检测平台良好兼容，以便于分析。利用小型化的专用集成电路（ASIC）芯片显著缩小读出系统的尺寸，我们还开发了紧凑的256通道体外神经记录系统，并且显示出与商业记录系统相当的输入噪声特性。所开发的多通道MEA系统仅需很小的物理空间（12厘米×16厘米），而且只需重新设计印刷电路板（PCB）前端适配器就能轻松适配新的MEA设计。这就为配置高通道数记录系统提供了最大的灵活性。我们成功展示了可靠的多通道神经记录系统，并针对四种化学物质进行了基于神经元的高通量药物筛选实验。

随着每年待测试的药物化合物不断增加，高通量筛选（HTS）中对基于细胞的传感器的需求日益增长。在众多其他类型的基于细胞的传感器中，并行、无创且无标记的电监测平台有望发挥关键作用。本研究中开发的多通道MEA专注于电生理信号记录，但该平台可轻易扩展以安装阻抗监测或电流测量单元。我们期望，我们这种利用开源知识的定制方法将为改进和推广高通量MEA药物筛选平台的使用开辟新的途径，并有助于以高效且经济的方式探索各种化合物的神经生理效应。

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