Nat Commun | PhenoCycler空间蛋白组+scRNASeq+空间转录组多组学联合分析非小细胞肺癌中巨噬细胞特征

近期，来自英国剑桥大学的研究团队在《️Nature Communications》（IF= 14.7）杂志上发表文章“A replicating LCMV-based vaccine for the treatment of solid tumors”。在这项研究中，研究人员通过单细胞和空间转录组学分析了来自25名未经治疗的腺癌和鳞状细胞癌患者的大约900,000个细胞。结果显示，抗炎巨噬细胞与NK细胞/T细胞之间存在反比关系，并且肿瘤内NK细胞的细胞毒性降低。虽然在腺癌和鳞状细胞癌中观察也到相似的细胞类型组成，但各种免疫检查点抑制剂的共表达存在显著差异。

此外，文章还展示了肿瘤中巨噬细胞转录“重编程”的证据，将它们转向胆固醇输出，并采用类似胚胎的转录特征来促进铁外排。研究利用PhenoCycler空间蛋白组学结合多组学资源提供了肿瘤相关巨噬细胞的高分辨率分子图谱，增强了我们对其在肿瘤微环境中的作用的理解。

️研究背景

肺癌是世界上发病率排行第二的癌症，也是癌症死亡的第一大原因，晚期患者的5年生存率约为6%。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型(约占总病例的85%)，其次是小细胞肺癌(占总病例的15%)。

肺癌是一种复杂的疾病，其中肿瘤微环境起着关键作用，巨噬细胞(Mɸ)密切参与疾病的进展。特别是肿瘤相关的M / h (TAMs)可以表现出双重作用，通过抑制免疫反应、促进血管生成和帮助组织重塑来促进肿瘤，但也通过促进炎症和参与对癌细胞的细胞毒性活性来抑制肿瘤。肺癌和Mɸ之间错综复杂的相互作用凸显了了解它们之间动态关系的重要性，了解其中机制可以帮助研究人员制定更有效的治疗策略。

️研究方案

研究人员将来自25名未接受治疗的肺腺癌LUAD或肺鳞癌LUSC患者的近90万个细胞的scRNAseq数据和来自8名患者的空间转录组学数据结合起来，研究肿瘤和邻近非肿瘤组织中细胞组织的差异。

随后，通过PhenoCycler空间蛋白组和对单细胞测序数据的深入分析，进一步验证了肿瘤环境中Mɸ的特殊性，并预测它们所经历的分子变化，包括一些类似于人类胚胎发育期间在Mɸ中观察到的变化。

️研究结果

️1. scRNA-seq描绘LUAD和LUSC的免疫微环境

为了确定LUAD和LUSC中免疫和非免疫细胞状态及其空间格局的异质性，研究人员收集了25例LUAD (n = 13)、LUSC (n = 8)或未确诊肺癌(LC, n = 4)的初治患者的肺组织切除术，以及2例健康的已故供体。通过收集肿瘤和匹配的正常非肿瘤组织(即背景)，分离CD45+免疫细胞以及肿瘤和其他非免疫群体，并进行scRNA-seq。

单细胞测序结果与之前的研究结果类似，肿瘤样本中单核细胞和未成熟骨髓细胞的比例与对照样本相比显着降低。在肿瘤中，显著较高比例的NK细胞具有较低的细胞毒性表型，并且绝大多数DC来自单核细胞。同样，结果显示表达LYZ和TNF的B细胞增加，而NKB细胞减少。在T细胞中，肿瘤样本显示了调节性T细胞(Tregs)的积累，已知其会阻碍肿瘤的免疫监视。相反，肿瘤中耗尽的细胞毒性T细胞减少并且γδ T细胞缺失，这些与非小细胞肺癌的存活率有关。γδ T细胞能够识别和裂解不同范围的癌细胞，因此被认为在泛癌症免疫治疗中发挥作用。

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最后，研究人员发现抗炎Mɸ (AIMɸ)的异质性和比例均增加，肿瘤组织中大量存在循环抗炎Mɸ、STAB1 + Mɸ和CAMLs。并且，研究发现患者中STAB1 + Mɸ /AIMɸ的频率与T/NK细胞之间存在很强的负相关，这显示出了Mɸ在抑制肺肿瘤组织中细胞毒性细胞浸润方面的关键作用。因此，非小细胞肺癌中单核细胞来源的Mɸ表现为免疫抑制表型，并抑制NK细胞的浸润。

️2. LUAD和LUSC细胞-细胞相互作用网络的异同

研究人员通过CellPhoneDB分析单细胞测序结果，推断在对照样本或健康组织及其相应的细胞类型中具有统计学意义的配体-受体对(L-Rs)，确定了在每种肿瘤类型环境中专门观察到的细胞-细胞相互作用的假定列表。尽管两种肿瘤亚型在涉及非免疫细胞、AIM ɸ和T细胞之间表现出相似的相互作用网络，但也存在一些显著差异。研究还观察到支持淋巴样细胞激活所需的关键共刺激信号，这些信号通常与异位淋巴样器官的存在有关，它们通常由B细胞、T细胞和DC等组成，如三级淋巴样结构(TLS)。

之后将单细胞测序结果与空间转录组结果整合在一起，分析组织原位L-R相互作用。结果证实了上述几种肿瘤特异性L-Rs在肿瘤中的共定位明显高于对照组切片，包括NRP1-VEGFA和ICIs NECTIN2-TIGIT, LGALS9-HAVCR2和CD96-NECTIN1。与CellPhoneDB结果一致，PD1-PDL1在肿瘤切片中没有明显的共定位。

️3. TAM促进肿瘤内胆固醇和铁的外排

为了更好地了解不同M ɸ群体在TME中的变化，研究人员进行了DEA分析。在肿瘤中，与对照组织相比，AM和AIM都上调了参与胆固醇和脂质转运和代谢的基因(如ABCA1、APOC1、APOE、FABP3和FABP5)。为了验证TME中胆固醇水平的升高，研究人员用BODIPY™493/503(一种靶向胆固醇和其他中性脂质的染色剂)对匹配的肿瘤和对照组织切片进行染色。与对照组织相比，肿瘤切片中BODIPY信号显著增加，证实肿瘤中中性脂质增加，这可能是由于TAM输出胆固醇增加的结果。

随后，通过PhenoCycler空间蛋白组学技术在肿瘤组织切片中发现了STAB1+Mɸ细胞（如下图），并使用DEA鉴定了一组与肿瘤AIMɸ或AMɸ相比较的STAB1+Mɸ的特异性基因。研究共鉴定了20个基因，称为“STAB1标志基因”。STAB1+Mɸ是唯一表达SLC40A1的Mɸ，该蛋白编码铁转运蛋白，铁转运蛋白是唯一已知的从细胞质跨质膜输出亚铁的蛋白，是巨噬细胞释放铁活性的关键。有报道显示，铁转运蛋白介导的M2 Mɸ释放游离铁可促进体外肾癌细胞的增殖，可能是由于DNA合成增加而产生高铁需求。

此外，与AMɸ相比，STAB1+Mɸ表达较低的铁蛋白重链1 (FTH1)和铁蛋白轻链(FTL)编码铁储存蛋白。与它们持续向细胞外环境输出游离铁的假设一致，STAB1 +M ɸ下调了参与铁封存的基因。总之，巨噬细胞在TME内经历“重编程”，并采用一种转录特征，促进胆固醇外排和铁输出，从而支持肿瘤进展。

研究人员还在邻域图上进行了Leiden聚类，用来评估关注的细胞类型在聚类中分布情况，并比对不同样本之间的相似性。研究采用层次聚类方法，在空间上估计细胞类型之间的相关距离，构建树状图。

结果显示，肿瘤中的巨噬细胞数量，特别是STAB1 + Mɸ，与胚胎巨噬细胞相关。STAB1 + Mɸ主要与胚胎SPP1 + M ɸ聚集，占参考文献报道的所有胚胎肺巨噬细胞的80%以上。与此发现一致，与其他造血细胞群体相比，SPP1 + Mɸ具有高表达的“STAB1特征基因”。这些分析证实了，当肿瘤环境中的单核细胞分化为抗炎巨噬细胞时，获得了类似于胚胎巨噬细胞的转录特征。而在周围正常组织的巨噬细胞中没有观察到这种独特的转录特征。因此，肿瘤组织中的STAB1 + Mɸ发生癌胚重编程。

️总结

当前，肿瘤微环境研究通常采用多组学联合的方式，采用PhenoCycler空间蛋白组技术、单细胞测序、空间转录组技术等多种技术结合，并且关注细胞内的信号转导情况和代谢水平变化，在不同层面上对所研究的课题进行验证和分析。其中，PhenoCycler空间蛋白组技术可以在同一张组织切片上一次检测多种细胞类型和细胞状态/代谢水平等。同时可以对一类细胞进行更加详细的亚型分型，为肿瘤微环境的进阶研究提供了非常有帮助的平台。

参考文献

1. De Zuani M, Xue H, Park JS, Dentro SC, Seferbekova Z, Tessier J, Curras-Alonso S, Hadjipanayis A, Athanasiadis EI, Gerstung M, Bayraktar O, Cvejic A. Single-cell and spatial transcriptomics analysis of non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2024 May 23;15(1):4388. doi: 10.1038/s41467-024-48700-8. PMID: 38782901; PMCID: PMC11116453.